可被单一限制酶切割用作克隆载体的λ噬菌体DNA的制备实验
实验方法原理 | 在某些情况下,制备好的λ噬菌体DNA经限制酶的简单消化即可用于克隆。但只有当所用载体能用遗传学方法筛选含有外源DNA序列的重组噬菌体时(如EMBL系列、λ2001、λDASH、λZAP、λgt10),这种方案才是可行的。因为在这种情况下,不必采取步骤来减少非重组噬菌体的形成。 | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
实验材料 | 噬菌体T4DNA连接酶带有合适缓冲液的限制性内切核酸酶 试剂、试剂盒 | ATP氯仿EDTA乙醇酚:氯仿乙酸钠焦糖凝胶上样缓冲液 仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶
实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 ATP(10mmol/L) 氯仿 EDTA(0.5mol/L,pH8.0) 乙醇 酚:氯仿(1:1,V/V) 乙酸钠(3mol/L,pH7.0)(使用pH7.0而不是常用的pH5.2的乙酸钠非常重要。因为对在消化后用来除去缓冲液中二价阳离子的EDTA来说,在pH5.2且浓度超过5~10mmol/L时,将从溶液中沉淀出来。) 焦糖凝胶上样缓冲液(sucrosegel-loADIngbuffer) TE(pH7.6和pH8.0) 2.酶和缓冲液 噬菌体T4DNA连接酶 带有合适缓冲液的限制性内切核酸酶 3.凝胶 琼脂糖凝胶(0.7%),用0.5XTBE,含0.5μg/ml溴化乙锭 4.核酸和寡核苷酸 λ噬菌体DNA 5.专用设备 预置于68℃的水浴 6.载体和菌株 λ噬菌体包装混合物 二、方法 1.将25~50μgλ噬菌体DNA与TE(pH8.0)混合至终体积为170μl。 2.加入20μl10X限制酶缓冲液。取两份未消化的噬菌体DNA,每份含0.2μg,置于冰浴保存。 3.加入3倍过量(75~150单位)的适宜限制酶,按厂家推荐的温度消化1h。 4.将反应于冰浴冷却至0℃。再取出一0.2μg的组分,将其与另一份未经消化的DNA(步骤2)于68℃温育10min,以打断噬菌体DNA黏性末端。加小量(10μl)蔗糖凝胶上样缓冲液,立刻将样品加入至0.7%的琼脂糖凝胶中。 如果限制酶消化完全,则没有DNA迁移至未消化的对照电泳带处。相反,将会看到两条或更多条(依赖于载体中切割位点的数目)较小DNA片段。仔细査看这些小片段的数量确证不存在部分酶切产物。 这一步并不像听起来那么简单。λ噬菌体DNA的左、右臂带有可互补的长为12碱基的末端,它们相互间可发生复性形成氢键,得到的DNA很容易与未切断的噬菌体DNA相混肴。由于这个原因,当DNA样品从68℃水浴取出后应立即上样和进行琼脂糖电泳。 如果消化不完全,将反应加热至适宜温度,再加入限制酶(50~100单位),在厂家推荐的最佳温度下继续温育。 5.当消化完全后,加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)至终浓度为5mmol/L,用酚:氯仿和氯仿各抽提消化混合物一次。 6.在0.3mol/L乙酸钠(pH7.0)存在下,用乙醇沉淀将DNA从亲水相中回收回来。于4℃在微量离心机中以最大转速离心2min收集沉淀,用70%乙醇洗涤后,将DNA重溶于100μlTE(pH7.6)中,通过测定260nm的吸光率确定其浓度。 7.取一份0.5μgDNA,如下所述测试其连接能力: (1)用水将DNA溶液的体积调整至17μl。 (2)加入2μl10X连接缓冲液,如果必要,再加入1μl10mmol/LATP。 有些商品化连接缓冲液中含有ATP。如果用这样的缓冲液,就不再需要另加ATP。 (3)取5μl步骤(2)中制成的混合物,冰浴保存。 (4)在剩余的混合物(步骤(2))中,加入0.2~0.5weiss单位的T4DNA连接酶,16℃温育2h。 (5)用一商品化的λ噬菌体包装反应将0.1μg的连接和未连接样品以及0.1μg的未消化载体DNA进行包装。 免责声明 本文仅代表作者个人观点,与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实,对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺,请读者仅作参考,并请自行核实相关内容。
版权声明 未经蚂蚁淘授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的,应该授权范围内使用,并注明“来源:蚂蚁淘”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
发布于 : 2019-06-25
阅读(115)
▍
相关分类
▍
相关文章
Immunomedics公司ADC药物三阴性乳腺癌III期研究成功 提前 ...
运动导致活性氧增加的nadph氧化酶途径的研究论文
丙氨酸转氨酶(ALT)活性检测试剂盒_价格厂家供应商_上海恒渡生物科 ...
Echinomycin,HIF1alpha抑制剂| Abcam中国
陆晨一名家专栏一金融界 jrj.com.cn
巴豆腈(CAS # 4786203)供应商 Chemblink Inc.
...Cloning Kit 零背景TOPOBlunt平末端克隆试剂盒_价格厂家供应...
DD5医用DD5大容量离心机上海离心机_DD5大容量离心机,不锈钢实验...
[老年痴呆]老年痴呆症诊断试剂盒 【神经内科讨论版】
Josunshiny的个人空间 ( ゜ ゜)つロ 乾杯~ Bilibili
7 年分子克隆经验总结
CHOHCVNS4B细胞 中国仓鼠卵巢细胞 亚系克隆试剂盒
▍
相关问答
|