一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

以50ul反应体系为例。

PlatinumQuantitativePCRSuperMix-UDG(Invitrogen11730-025)        25ul

ROX染料（Invitrogen12223012)                                                       1ul

灭菌的蒸馏水（Gibco15230-162)                                                     10ul

10umol/L反向引物I                                                                             1ul

10umol/L正向引物I                                                                             1ul

10umol/L反向引物II                                                                            1ul

10umol/L正向引物II                                                                            1ul

小计                                                                                                   40ul

溶于0.1XTE或无菌水的模板                                                               10ul

总计                                                                                                    50ul

2.专门的仪器

ABIPrism7700型号系列检测系统。

二、方法

1.PCR循环时的温度条件与方案2相同

典型的多元扩增结果见图15-3(见封二彩图)。实验以白介素-4为目的基因，以肌动蛋白基因（看家基因）为参照基因。结果表明，当β-肌动蛋白基因为10⁶拷贝数时，对白介素-4的定量范困为22~3X15拷贝。对PCR条件没有进一步优化，体系中试剂的浓度与一元扩增时的完全相同。以防实时PCR效率下降，可以按照下面步骤对PCR体系进行优化。

2.优化多元反应的条件

a.对于高风度基因（特别是看家基因）其引物浓度可以降低到其他基因引物浓度1/4。

b.MgCl₂浓度从3mmol/L升到6mmol/L。

c.每种dNTP浓度提高到400umol/L。

d.聚合酶的酶量加倍（反应体系中每1ul为0.06U)。也可以使用PlatinumTaqDNA优质聚合酶（Invitrogen10966-018)。