用 PCR 控制基因组 DNA 文库的质量实验
试剂、试剂盒 | ddH20Vent缓冲液VentDNA聚合酶dNTP质粒DNAPCR引物 仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备热循环仪 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液、溶液和试剂 ddH20 2.酶和酶缓冲液 10XVent缓冲液 VentDNA聚合酶 3.核酸和寡核苷酸 dNTP,各20mmol/L PCR引物,可以与基因组DNA文库克隆位点两侧的载体序列退火 质粒DNA(见下面第1步) 4.特殊设备 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备,包括溴化乙锭(见第5步) 热循环仪 二、方法 1.在细菌中扩增后,用基因组文库制备的质粒DNA建立下列反应。 10~50ng的质粒DNA 50pmol的各引物 5ul的10XVent缓冲液 dATP、dCTP、dTTP和dGTP,各0.5ul 1U的VentDNA聚合酶 用ddH20定容至50ul 对下面的每种质粒载体应该分别进行反应: 表达载体,没有文库DNA插入 基因组DNA文库的混合物 少量DNA,由基因组DNA文库的单个细菌克隆制备 2.在一个热循环仪中,94°C将混合物预热20s。 3.按下面的参数进行30轮PCR循环。 94°C15s 55°C10s(或用引物的合适退火温度) 72°C40s 将最后一次循环的延伸时间延长至60s。 4.冷却至4C。 5.取25ul的各反应产物,跑4%的琼脂糖凝胶电泳,并用溴化乙锭染色分析(SambrookandRussell2001) 三、分析 在图26-6所示的例子中,对文库混合物进行PCR分析,其中用的引物是PmlⅠ位点的侧翼序列,结果显示,文库中含有目的大小的插入片段,但有大量的原始载体的污染[图26-6(a),第2泳道]。从文库中选择单个克隆进行PCR分析,验证了用文库混合物做模板的结果,显示文库中的原始载体大约占40%[所分析的24个克隆中有10个,图26-6(a),第3~26泳道]。为了提高文库的质量,用PmlⅠ酶消化文库,然后在细菌中重新进行扩增,以减少原始载体的污染。对文库混合物进行PCR分析显示,用PmlⅠ消化后,无插入的环状载体的污染大大减少了[图26-6(b),第2泳道和第3泳道]。用PmlⅠ消化又重新在细菌中扩增后,在文库中随机选择单个克隆进行PCR分析,证实无插入DNA的出现频率比原始文库大大降低[20个克隆中有0个,小于5%,图26-6(b),第4~23泳道],并且克隆中含有预计大小的插入片段。对基因组片段文库中的克隆进行DNA序列分析显示,文库中含有预计大小的人类基因组DNA片段(数据没有列出)。因此,PCR提供了一个快速、敏感和方便的方法,来分析原始的和改善过的文库。 |
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发布于 : 2018-08-06
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