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CN107385014A_一种直接定量检测循环miRNA的RT‑qPCR方法在审

专利基本信息
申请号CN201710442989.5申请日2017-06-13
公开(公告)号CN107385014A公开(公告)日2017-11-24
申请公布号CN107385014A申请公布日2017-11-24
分类号C12Q1/68(2006.01)I分类生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
发明人苟德明;牛燕琴;康康申请(专利权)人
代理机构广州番禺容大专利代理事务所(普通合伙)代理人刘新年
地址518060广东省深圳市南山区南海大道3688号粤海门广场A207
摘要本发明涉及生物医学领域,具体涉及一种不需提取核酸,直接检测血清或血浆中循环microRNA(miRNA)的实时荧光定量RT‑qPCR方法。所述方法包括:S1:裂解血清或血浆中的外泌体及miRNA蛋白复合体,离心后得到循环miRNA粗提物;S2:miRNA加尾及逆转录;S3:RT‑qPCR定量检测。本发明miRNA直接荧光定量RT‑qPCR扩增方法[Direct S‑Poly(T)Plus,简称DSPP]中,不需要提取核酸,且miRNA的Poly(A)加尾和逆转录将在一个反应体系中同步完成,操作简便,缩短时间,可在95分钟内完成cDNA的制备。该技术体系灵敏度与stem‑loop方法相比提高数十甚至上百倍,建立了一种非常简便、灵敏、高效、快捷、廉价的miRNA检测的技术体系。该技术体系尤其适合于临床应用推广及其从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miRNA。
一种直接定量检测循环miRNA的RT‑qPCR方法

鸽肉含有多种氨基酸、维生素及微量元素;鸽蛋也是养生、滋补的佳品。随着国内外鸽子市场消费水平的增长,越来越多的商家投入到鸽子生产中,鸽子的繁育和发展受到了更多的关注。鸽子属于单态性鸟类,即雌雄性别在外观上表现一致。鸽子还是典型的“一夫一妻”制的繁殖方式,如果性别比例不当,不仅会使鸽群不安定,还会影响繁殖,降低产蛋率,所以雌雄鉴别在鸽子养殖业中具有重要作用。

鸽子作为晚成鸟,雏鸽体型小且雌雄外貌形态差别甚微,不像一般家禽可以从外形上区分雌雄。因此,人们对鸽子的雌雄鉴定主要依赖分子生物学方法,而其中CHD-W基因鉴定法最为常用。CHD1(chromo-helicase-DNAbindingprotein-1)在非平胸鸟类的Z、W染色体都有分布,两者的外显子序列和大小相似,内含子大小却有很大差别。国内外学者根据这个特性,利用内含子两侧保守序列设计特异性引物,使用PCR方法对CHD-W进行扩增,用于多种非平胸目鸟的性别鉴定,并取得了显著进展。

然而,一方面现有的引物主要针对普遍的非平胸目鸟类,与特定鸟类的基因吻合度低,PCR效果较差;另一方面现有的引物扩增雌性两条带大小差别不大,不易区分,容易造成判断失误;而且,在鸽子基因组DNA的提取过程费时费力,还容易造成样品污染,影响检测结果。



技术实现要素:

本发明要解决的技术问题是提供一种技术实用性强、重复性好、效率高的直接对血液扩增鉴定鸽子性别的方法。该方法既可节约鸽子基因组DNA提取的成本,降低样本污染的风险和假阳性的概率,又可以用于鉴别外观上难以区分性别的鸽子的性别鉴定。

本发明的目的之一是提供一种鉴定鸽子性别的引物对。该引物对为:

上游引物CHd-WL1(SEQIDNO:1,5’CTCTGGGTTTTGACCAACTA3’);

下游引物CHd-WR1(SEQIDNO:2,5’ATATCTTACCGCCTGATCTC3’)。

本发明的目的之二是提供一种鉴定鸽子性别的PCR试剂盒。该试剂盒包括:所述引物对SEQIDNO:1和SEQIDNO:2、LAPCRbuffer、dNTPs、PEC-1和OmniKlentaq。

最后,本发明的目的提供一种鉴定鸽子性别的方法。具体步骤如下:对NCBI数据库中公布的多种鸟类CHD1序列进行比对,确定较为保守的区域,设计一对原创性引物对,引物对名称为CHd-WL1(核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)和CHd-WR1(核苷酸序列如SEQIDNO:2所示),该引物与其他已报道的禽类性别鉴定的引物完全不同,可用于鸽子性别的分子鉴定。采集鸽子翅静脉的新鲜血液或者抗凝管(EDTA)收集的冻存血,利用该引物对进行PCR扩增,PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳后扩增产物为单一条带,可以判定该个体为雌性;电泳后扩增产物无条带,可以判定该个体为雄性。

与现有技术相比,本发明直接使用鸽子血液进行PCR检测,不仅节省了成本和劳动时间,还降低了样本污染的风险和假阳性的概率;在保守区域设计引物用于鸽子性别的鉴定,PCR扩增效果好,电泳检测条带清晰,结果易读,可以准确地判定鸽子性别;本发明设计引物通用性强,适用于鸽子品种包括但不限于白卡鸽、白王鸽、深王鸽、泰森鸽、银王鸽等。本发明使用血液直扩鉴定鸽子性别,是一种技术实用性强、重复性好、效率高的的方法。

附图说明

图1实施例中鸽子血液直接PCR产物电泳后的图谱;其中电泳图谱第一行:白卡1-8为白卡鸽,深王1-8为深王鸽,白王1-8为白王鸽;电泳图谱第二行:银王1-8号为银王鸽,泰森1-8为泰森鸽,B为空白对照。图中M为Marker,♀为雌性,♂为雄性。

具体实施方式

下面参考具体实施例,对本发明进行说明,需要说明的是,这些实施例仅仅是说明性的,而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明,实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,可以参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译,第三版,科学出版社)或者相关产品进行,所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法,所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者,均在首次出现时标明,其后所用相同试剂如无特殊说明,均以首次标明的内容相同。

实施例

1、鸽子血液采集

本发明的样品来源于鸽子5个品种:白卡鸽、白王鸽、深王鸽、泰森鸽、银王鸽,每个品种雌雄各4只。先将鸽子侧卧保定,露出腋窝处,拔去该部羽毛,可见翼下静脉,压迫翼下静脉的近心端,使血管怒张,消毒后,手持采血针由翼根向翅膀方向沿静脉平行刺入,采完后要压迫止血。采集的血液可直接检测或者抗凝管(EDTA)收集-20℃冷冻保存。

2、引物设计

对NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中公布的多种鸟类CHD1序列进行比对,确定保守的区域,利用primer5.0设计一对原创性引物对:CHd-WL1(核苷酸序列SEQIDNO:1CTCTGGGTTTTGACCAACTA)和CHd-WR1(核苷酸序列SEQIDNO:2ATATCTTACCGCCTGATCTC),该引物与其他已报道的禽类性别鉴定的引物完全不同,可用于鸽子性别的分子鉴定。

3、PCR扩增

20μl反应体系中加入鸽子血液0.8μl、LAPCRbuffer2μl、上下游引物各0.6μl、dNTPs1μl、PEC-15μl、OmniKlentaq0.3μl、ddH2O9.7μl。其中:LAPCRbuffer来自宝生物工程(大连)有限公司的10×LATaqBufferII(Mg2+plus)(CodeNo.9153A),dNTPs购于宝生物工程(大连)有限公司(CodeNo.4030Q),PEC-1增强剂购于VitaNaviTrchnology(VN260P),OmniKlentaq直扩酶来自美国Enzymatics公司的Omni(P7500-HC-F),ddH2O为高压灭菌的去离子水,引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成,工作浓度为10μM。表1是PCR的反应体系。

PCR反应条件为:98℃5min,35个循环:95℃30s,54℃30s,72℃45s,后72℃延伸5min,反应产物于4℃保存。

表1

4、性别鉴定

将PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。鸽子性别鉴定检测结果如图1所示:其中电泳图谱第一行:白卡1-8为白卡鸽,深王1-8为深王鸽,白王1-8为白王鸽;电泳图谱第二行:银王1-8号为银王鸽,泰森1-8为泰森鸽,B为空白对照。图中M为marker,是天根生化科技(北京)有限公司的100bpDNAladder,♀为雌性,♂为雄性。从扩增产物电泳图谱可知:扩增产物电泳为单一条带的是雌鸽,长度约370bp;扩增产物电泳无条带的是雄鸽。

5、序列分析

由于雄性鸽子不能扩增出目的条带,因此我们将经过鉴定的雌鸽样本的PCR扩增产物送华大基因测序,以验证性别鉴定的准确性。雌鸽样本的PCR扩增产物测序峰图使用Chromas软件查看,测序碱基序列结果使用DNAMAN软件查看,并使用DNAMAN软件将鸽子的测序碱基序列和NCBI数据库公布的多种鸟类的CHD1序列进行对比分析,结果显示扩增序列与参考序列有很高的一致性,说明我们扩增的序列为CHD1基因,进而说明我们设计的引物性别鉴定的结果是真实可靠的。

本发明方法技术实用性强,重复性好,效率高。直接使用鸽子血液进行PCR检测,不仅节省了成本和劳动时间,还降低了样本污染的风险和假阳性的概率。以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。



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