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一种直接定量检测循环m i RNA的RT-qPCR方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学领域,具体涉及一种不需提取核酸,直接定量检测循环miRNA 的RT-qPCR方法。

背景技术

[0002] MicroRNA (miRNA)是一类长约22个核苷酸非编码小RNA,广泛存在于动物、植物、线 虫等真核生物中。miRNA通过与祀mRNA的3’端非翻译区(3’ -UTR)结合,降解祀mRNA或者阻止 其翻译,从而在转录后水平上调控基因的表达。功能上,miRNA广泛参与细胞的分化、增殖、 凋亡、个体生长发育以及器官形成。生物体内miRNA表达被精细调控,具有严格的时空特异性。 研究发现,血液中存在着循环miRNA且非常稳定,更为重要是,循环miRNA的异常与许多疾病 的发生发展密切相关,可作为癌症等重大疾病早期诊断和预后评估的新型生物标记物。

[0003] 长期以来,基于实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的检测技术一直都被认为是最灵敏的 miRNA检测手段之一,比较常用的有poly (A)加尾法(Shi R,Biotechnique · 2005,39 (4): 519-525)和茎环引物(Stem loop)法(Chen C,Nucleic Acids Res.2005,33 (20): 1-9)。 Poly⑷加尾法是利用poly⑷聚合酶使miRNA的3’端带上一段poly⑷尾巴,然后用含有 Olig0 (dT)序列引物进行逆转录。由于逆转录引物的通用性,因此Poly㈧加尾法在降低检 测成本的同时,也降低了检测的特异性和灵敏性。茎环引物法中逆转录引物5’端含有一个 茎环结构,3’端通常具有6个与miRNA3’端配对的特异性碱基,可以特异性的进行逆转录反 应。但是由于茎环引物法使用的是序列特异性探针,在高通量的miRNA分析中成本相对昂 贵,此外,依赖于6个匹配碱基在结合力度方面显然是不够的,会显著降低cDNA合成的效率。

[0004] Kang K等发明了一种新型的检测miRNA的方法S-Poly⑴法,分别在其专利申请 CN102154505A (在该专利中称为S-S-Oligo (dT)法,所用引物称为S-S-Oligo (dT)引物)和文 章(Kang,K,PloS one.2012.7,e48536.)中进行了公开。在S-Poly⑴方法中,所用引物从5’ 端开始依次是14-20个碱基的PCR通用引物序列,14-20个碱基的通用探针序列,8-30个dT及 与目的miRNA分子的3’端3-8个核苷酸互补配对的特异性序列。与poly㈧加尾法和茎环引 物法相比,S-Poly (T)方法的特异性和灵敏度都大大提高,灵敏度至少提高10倍以上。在升 级版的S-Poly⑴Plus方法中(专利申请号:201510558101.5),miRNA的Poly㈧加尾和逆转 录一步反应完成,因此在操作简便性和逆转录效率方面,S-Poly⑴Plus技术又有进一步改 进和提高,其总体灵敏度比S-Poly (T)方法提高2-8倍。

[0005] 现有miRNA检测方法都是基于纯化的RNA为模板,由于提取核酸中RNA沉淀和回收 的不完全,将会不可避免的造成一些RNA丢失。此外,RNA提取过程费时,易造成污染和降解。

[0006] 可见,现有技术还有待完善。

发明内容

[0007] 鉴于此,有必要针对上述问题提供一种不需提取核酸,更为简便、灵敏、高效、廉价 的直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法,称之为Direct S-Poly (T) Plus (DSPP)。

[0008] 为了实现上述发明目的,本发明包含以下技术方案:

[0009] 一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法,所述方法不需提纯核酸,将miRNA从 蛋白复合体中裂解出来,直接进行RT-qPCR检测。

[0010] 进一步的,所述直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法,包含以下步骤:

[0011] S1、裂解离心:利用裂解用试剂将样本中的蛋白复合体中充分裂解,使miRNA从样 本中的蛋白复合体中释放出来;将所得的混合物离心,得上清即为粗提RNA,40u 1的混合物 可以吸取约35ul上清;

[0012] S2、加尾逆转录:将所述步骤Sl中所获得粗提RNA进行加Poly (A)尾及S-Poly⑴特 异性逆转录;

[0013] S3、RT-qPCR定量检测:以步骤S2中获得的逆转录产物cDNA为模板进行RT-qPCR定 量检测。

[0014] 进一步的,所述步骤Sl中所述样本用量为20〜50ul。

[0015] 进一步的,所述步骤Sl中裂解用试剂包括组分:20ul 2Xlysis buffer、lul蛋白 酶K,所述裂解用试剂对应处理20ul样本。

[0016] 进一步的,所述2 X lysis buffer包含以下终浓度的组分:100mmol/lTris-HCl、 300mmol/lNaCl、20mmol/lMgCl2;pHS8.0。

[0017] 进一步的,所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。

[0018] 进一步的,所述裂解条件为50°C处理20分钟,然后95°C保持5分钟。

[0019] 进一步的,所述步骤Sl中的离心条件为:10,000〜14,000g,4°C条件下离心5〜15 分钟;优选13,OOOg,4°C条件下离心5分钟。

[0020] 进一步的,所述步骤S2中加尾逆转录的反应体系包含多聚腺苷酸聚合酶(polyA polymerase)和逆车专录酉每(reverse transcriptase) 〇

[0021] 进一步的,所述步骤S2中加尾逆转录反应体系中所加入粗提RNA模板的体积百分 比为5〜75%,优选40 %。

[0022] 进一步优选地,加尾逆转录的反应体系包含:0.5-7.5uL上清模板、1 ±0.2yL的0.5 ymol/L RT primer、l±0.2U的PolyA Polymerase、100±20U的MMLV、2.375-0.625uL的 reaction buffer、RNase_free Water补足至IOyL;加尾逆转录的反应条件为:37〜42°C保 温50〜70min,74〜76°C保温3〜7min以灭活酶,然后迅速置于冰上,静置2min以终止灭活。

[0023] 进一步优选地,加尾逆转录的反应体系包含:4uL上清模板,IyL的0.5μΜ RT primer,IU的PoIyA Polymerase,100U的MMLV,1·5yL的reaction buffer,RNase-free Water补足至IOyL;加尾逆转录的反应条件为:37°C保温30min,42°C保温30min,75°C保温 5min以灭活酶,然后迅速置于冰上,静置2min以终止灭活。

[0024] 进一步的,所述步骤S3中以cDNA为模板进行real-time PCR定量检测,此过程使用 的DNA聚合酶为热启动酶,目的是减少非特异性扩增;real-time PCR反应体系为:4XqPCR reaction Buffer:5yL、lymol/L Forward Primer 4yL、10ymol/L universal reverse primerO.10ymol/L universal Taqman probe0.5yL、100XROX Rerference DyeO.2μ L、hotstart Alpha Taq PolymeraseO.0125yL、cDNA0.5yL、RNase_free Water加至20yL;反 应条件为:预变性95 °C 5分钟,变性95 °C I Os,退火60 °C 40s,40个循环。

[0025] 进一步的,所述热启动酶的制备方法为:将DNA聚合酶和热启动抗体等体积混合, 室温放置6小时。

[0026] 进一步的,所述样本包括血清、血浆/血清、尿液、眼泪、乳汁、唾液、痰液或粪便抽 提上清;优选样本为血浆。

[0027] 本发明有益效果:

[0028] 1、本发明Direct S-Poly (T) Plus方法中,不需要提取核酸的步骤,定量检测 miRNA,其流程图如图1所示。操作简便,缩短时间,制备cDNA的时间至少减少70 %以上,简便 性优于传统方法。

[0029] 2、本发明Direct S-Poly⑴Plus方法在逆转录这一步对于模板量要求范围更宽, 5%-75%的粗提RNA均可满足逆转录要求,转录效率优于传统方法。

[0030] 3、本发明中的技术体系尤其适合于从m i RNA丰度较低的生物体液样本中检测 miRNA。本发明方法的灵敏性显著高于传统方法。比如灵敏性方面,20ul的体液样本就可以 实现175个miRNA的检测。

[0031] 4、本发明Direct S-Poly (T) Plus方法能从包括血清、血浆/血清、尿液、乳汁、唾 液、痰液、粪便抽提上清及细胞培养液等生物体液样本中高效检测miRNA,检测效率比传统 方法高出一个数量级,从而提高了体液miRNA定量检测的灵敏性和准确性。

[0032] 5、本发明的简便性、灵敏性和特异性使其在疾病早期筛查和预后评估等研究方面 有重要应用前景,可广泛用于肿瘤、心血管病或其它重大疾病的早期无创筛查。

附图说明

[0033] 图1为miRNA直接RT-qPCR荧光定量检测流程(Direct S-Poly⑴Plus)。其中,在加 尾逆转录体系中,4u 1粗提RNA作为模板为最优方案。

[0034] 图2为Direct S-Poly⑴Plus方法中不同裂解方案的效果比较。

[0035]图3为Direct S-Poly (T) Plus方法中一步法(加尾和逆转录反应一步完成)和两步 法(先加尾后进行逆转录反应)的差别。

[0036] 图4为Direct S-Poly⑴Plus方法中起始粗提RNA加入比例。

[0037] 图5用Direct S-Poly (T) Plus比较同一志愿者的血清血浆中miRNA表达量。***P〈0 · 001 〇

[0038] 图6以提取的RNA为模板,用S-Poly (T) Plus方法比较同一志愿者血清和血浆中 miRNA的表达量。用miR-cel-54做归一化内参,*#P〈0.001。

[0039] 图7为热启动Alpha Taq Polymerase对Direct S-Poly⑴Plus方法中非特异性扩 增减少作用。

[0040] 图8为hsa-miR-15b_5p扩增曲线,-RT :不加逆转录酶的阴性对照,检测方法为 Direct S-Poly⑴Plus。

[0041] 图9为热启动Alpha taq polymerase用量对miRNA检测Ct值的影响(20ul体系),检 测方法为Direct S-Poly (T) Plus。

[0042] 图 10为使用0.4ul Hotstart Alpha Taq Polymerase miRNA的阴性对照(不加逆 转录酶)扩增曲线(20ul体系),检测方法为Direct S-Poly⑴Plus。

[0043] 图 11 为使用0.0125ul Hotstart Alpha taq Polymerase miRNA的阴性对照(不加 逆转录酶)扩增曲线(20ul体系),检测方法为Direct S-Poly⑴Plus。

[0044] 图12为Direct S-Poly⑴Plus方法的灵敏度和线性范围。

[0045] 图13为三种miRNA检测方法灵敏度比较。

[0046] 图14为六个在结直肠癌初筛中显著变化的miRNA单个样本验证。验证方法为 Direct S-Poly ⑴ Plus。数据为土 SE,**P〈0 · 01,***P〈0 · 001,ns,不显著。

[0047] 图15为六个在结直肠癌初筛中显著变化的miRNA单个样本验证。验证方法为S-Poly ⑴ Plus (内参为miR-cel-54)。数据为土 SE,**P〈0 · 01,***P〈0 · 001,ns,不显著。

具体实施方式

[0048] 为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果,现结 合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是,本发明内容包含但不限于以下实施 例及其组合实施方式。

[0049] 如无特别说明,以下实施例中所采用的各种原料均来源于市场销售,所采用的方 法均为常规方法,其中引物、探针来自美国Integrated DNA Technologies (IDT)公司。

[0050] 本申请中主要材料来源如下:

[0051] 血液来源于深圳市人民医院和北京大学深圳医院。血浆收集流程为:采血于含有EDTA 抗凝剂的采血管,4°C,3,000转离心10分钟,上清即为血浆;全血样本室温放置1小时,取血清4 °C,3,000转离心10分钟,上清即为血清。血清/血浆样本分装为20-50ul的体系,保存于-80 °C。

[0052] miRNA直接RT-qPCR荧光定量检测方法(Direct S-Poly (T) Plus)最优方案流程如 图1。在最优的方案中,20ul的血浆可以制备35ul粗提RNA,对应87.5ul cDNA。按照20ul qPCR体 系加入0.5ulcDNA,平均可以检测175个miRNA。忽略操作时间,整个miRNA检测流程只需140分钟。

[0053] 实施例I Direct S-Poly⑴Plus方法比较血浆和血清中的循环miRNA含量

[0054] 在本实施例中,同一志愿者血清和血浆同时作为模板,共收集了同一健康志愿者 的血清和血浆样本10对。用本发明中DirectS-Poly (T) Plus方法分别检测等量血清或者血 浆样本中的miRNA表达量。具体包含以下步骤:

[0055] Sl、裂解离心,具体步骤为:

[0056] I) 20uL血楽_/血清与20uL 2X lysis buffer混合均勾,加入IuL蛋白酶K,50°C处理 20分钟,然后95 °C保持5分钟,置于冰上;

[0057] 2)13,00(^,4°(:离心5分钟;吸取上清液(粗提1?熟)转移至另一新的离心管中或直 接用于S2;

[0058] S2、加尾逆转录:miRNA加Poly (A)尾和逆转录(第一链cDNA的合成)在一个反应体 系中进行,利用S-Poly⑴引物进行miRNA的逆转录。

[0059] 所述2 X lysis buffer包含以下终浓度的组分:100mmol/lTris-HCl、300mmol/l NaCl、20mmol/l MgCl2; pH为8 · 0;所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。

[0060] 加尾逆转录的反应体系包含:4uL粗提RNA,lyL的0.05μΜ RT primer (逆转录引 物),IU的PolyA Polymerase (多聚腺苷酸聚合_,100U的MMLV (鼠白血病逆转录_,1 · 5yL 的reaction buffer (反应缓冲液),RNase_free Water (无RNA酶水)补足至10yL。所述 reaction buffer包含以下终浓度的组分:200mM Tris_HCl,600mM NaCl,40mM MgCl2,4mM ATP,2mM dNTP,pH 8.0。加尾逆转录的反应条件为:37°C保温30min,42°C保温30min,75°C保 温5min以灭活酶,然后迅速置于冰上,静置2min以终止灭活。

[0061] 所述S-Poly(T)引物由四部分组成,其序列从5’端到3’端依次为:14-20个碱基的 PCR通用引物序列、14-20个碱基的通用探针序列、11个oligo(dT)和5-7个与miRNA 3’配对的 特异性碱基。更优选地,所述S-Poly⑴引物序列从5’端到3’端依次为:16个碱基的PCR通用 引物序列、17个碱基的通用探针序列、11个oligo (dT)和6个与miRNA 3’配对的特异性碱基。 [0062] 本发明中所检测的miRNA的序列来自于miRBase,根据各自序列设计不同的S-Poly ⑴引物、上游引物,检测不同miRNA的S-Poly⑴引物序列如表1所示。

[0063]表1、本发明中所使用的引物和探针

Figure CN107385014AD00071
Figure CN107385014AD00081

[0066] S3、PCR:以步骤S2中逆转录获得的第一链cDNA为模板,用miRNA特异上游引物和下 游通用引物进行real-time PCR定量检测。所述miRNA特异上游引物是不含3’端3-8个碱基 的miRNA特异序列,所述miRNA的下游通用引物来自于S-Poly⑴引物的14-20个碱基的通用 引物序列。


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