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    鸽肉含有多种氨基酸、维生素及微量元素;鸽蛋也是养生、滋补的佳品。随着国内外鸽子市场消费水平的增长,越来越多的商家投入到鸽子生产中,鸽子的繁育和发展受到了更多的关注。鸽子属于单态性鸟类,即雌雄性别在外观上表现一致。鸽子还是典型的“一夫一妻”制的繁殖方式,如果性别比例不当,不仅会使鸽群不安定,还会影响繁殖,降低产蛋率,所以雌雄鉴别在鸽子养殖业中具有重要作用。

    鸽子作为晚成鸟,雏鸽体型小且雌雄外貌形态差别甚微,不像一般家禽可以从外形上区分雌雄。因此,人们对鸽子的雌雄鉴定主要依赖分子生物学方法,而其中CHD-W基因鉴定法最为常用。CHD1(chromo-helicase-DNA binding protein-1)在非平胸鸟类的Z、W染色体都有分布,两者的外显子序列和大小相似,内含子大小却有很大差别。国内外学者根据这个特性,利用内含子两侧保守序列设计特异性引物,使用PCR方法对CHD-W进行扩增,用于多种非平胸目鸟的性别鉴定,并取得了显著进展。

    然而,一方面现有的引物主要针对普遍的非平胸目鸟类,与特定鸟类的基因吻合度低,PCR效果较差;另一方面现有的引物扩增雌性两条带大小差别不大,不易区分,容易造成判断失误;而且,在鸽子基因组DNA的提取过程费时费力,还容易造成样品污染,影响检测结果。



    技术实现要素:

    本发明要解决的技术问题是提供一种技术实用性强、重复性好、效率高的直接对血液扩增鉴定鸽子性别的方法。该方法既可节约鸽子基因组DNA提取的成本,降低样本污染的风险和假阳性的概率,又可以用于鉴别外观上难以区分性别的鸽子的性别鉴定。

    本发明的目的之一是提供一种鉴定鸽子性别的引物对。该引物对为:

    上游引物CHd-WL1(SEQ ID NO:1,5’CTCTGGGTTTTGACCAACTA3’);

    下游引物CHd-WR1(SEQ ID NO:2,5’ATATCTTACCGCCTGATCTC3’)。

    本发明的目的之二是提供一种鉴定鸽子性别的PCR试剂盒。该试剂盒包括:所述引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、LA PCR buffer、dNTPs、PEC-1和Omni Klentaq。

    最后,本发明的目的提供一种鉴定鸽子性别的方法。具体步骤如下:对NCBI数据库中公布的多种鸟类CHD1序列进行比对,确定较为保守的区域,设计一对原创性引物对,引物对名称为CHd-WL1(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)和CHd-WR1(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示),该引物与其他已报道的禽类性别鉴定的引物完全不同,可用于鸽子性别的分子鉴定。采集鸽子翅静脉的新鲜血液或者抗凝管(EDTA)收集的冻存血,利用该引物对进行PCR扩增,PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳后扩增产物为单一条带,可以判定该个体为雌性;电泳后扩增产物无条带,可以判定该个体为雄性。

    与现有技术相比,本发明直接使用鸽子血液进行PCR检测,不仅节省了成本和劳动时间,还降低了样本污染的风险和假阳性的概率;在保守区域设计引物用于鸽子性别的鉴定,PCR扩增效果好,电泳检测条带清晰,结果易读,可以准确地判定鸽子性别;本发明设计引物通用性强,适用于鸽子品种包括但不限于白卡鸽、白王鸽、深王鸽、泰森鸽、银王鸽等。本发明使用血液直扩鉴定鸽子性别,是一种技术实用性强、重复性好、效率高的的方法。

    附图说明

    图1实施例中鸽子血液直接PCR产物电泳后的图谱;其中电泳图谱第一行:白卡1-8为白卡鸽,深王1-8为深王鸽,白王1-8为白王鸽;电泳图谱第二行:银王1-8号为银王鸽,泰森1-8为泰森鸽,B为空白对照。图中M为marker,♀为雌性,♂为雄性。

    具体实施方式

    下面参考具体实施例,对本发明进行说明,需要说明的是,这些实施例仅仅是说明性的,而不能理解为对本发明的限制。

    若未特别指明,实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,可以参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译,第三版,科学出版社)或者相关产品进行,所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法,所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者,均在首次出现时标明,其后所用相同试剂如无特殊说明,均以首次标明的内容相同。

    实施例

    1、鸽子血液采集

    本发明的样品来源于鸽子5个品种:白卡鸽、白王鸽、深王鸽、泰森鸽、银王鸽,每个 品种雌雄各4只。先将鸽子侧卧保定,露出腋窝处,拔去该部羽毛,可见翼下静脉,压迫翼下静脉的近心端,使血管怒张,消毒后,手持采血针由翼根向翅膀方向沿静脉平行刺入,采完后要压迫止血。采集的血液可直接检测或者抗凝管(EDTA)收集-20℃冷冻保存。

    2、引物设计

    对NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中公布的多种鸟类CHD1序列进行比对,确定保守的区域,利用primer5.0设计一对原创性引物对:CHd-WL1(核苷酸序列SEQ ID NO:1 CTCTGGGTTTTGACCAACTA)和CHd-WR1(核苷酸序列SEQ ID NO:2ATATCTTACCGCCTGATCTC),该引物与其他已报道的禽类性别鉴定的引物完全不同,可用于鸽子性别的分子鉴定。

    3、PCR扩增

    20μl反应体系中加入鸽子血液0.8μl、LA PCR buffer 2μl、上下游引物各0.6μl、dNTPs 1μl、PEC-15μl、Omni Klentaq 0.3μl、ddH2O 9.7μl。其中:LA PCR buffer来自宝生物工程(大连)有限公司的10×LA Taq Buffer II(Mg2+plus)(Code No.9153A),dNTPs购于宝生物工程(大连)有限公司(Code No.4030Q),PEC-1增强剂购于VitaNavi Trchnology(VN260P),Omni Klentaq直扩酶来自美国Enzymatics公司的Omni(P7500-HC-F),ddH2O为高压灭菌的去离子水,引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成,工作浓度为10μM。表1是PCR的反应体系。

    PCR反应条件为:98℃5min,35个循环:95℃30s,54℃30s,72℃45s,后72℃延伸5min,反应产物于4℃保存。

    表1

    4、性别鉴定

    将PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。鸽子性别鉴定检测结果如图1所示:其中电泳图谱第一行:白卡1-8为白卡鸽,深王1-8为深王鸽,白王1-8为白王鸽;电泳图 谱第二行:银王1-8号为银王鸽,泰森1-8为泰森鸽,B为空白对照。图中M为marker,是天根生化科技(北京)有限公司的100bp DNA ladder,♀为雌性,♂为雄性。从扩增产物电泳图谱可知:扩增产物电泳为单一条带的是雌鸽,长度约370bp;扩增产物电泳无条带的是雄鸽。

    5、序列分析

    由于雄性鸽子不能扩增出目的条带,因此我们将经过鉴定的雌鸽样本的PCR扩增产物送华大基因测序,以验证性别鉴定的准确性。雌鸽样本的PCR扩增产物测序峰图使用Chromas软件查看,测序碱基序列结果使用DNAMAN软件查看,并使用DNAMAN软件将鸽子的测序碱基序列和NCBI数据库公布的多种鸟类的CHD1序列进行对比分析,结果显示扩增序列与参考序列有很高的一致性,说明我们扩增的序列为CHD1基因,进而说明我们设计的引物性别鉴定的结果是真实可靠的。

    本发明方法技术实用性强,重复性好,效率高。直接使用鸽子血液进行PCR检测,不仅节省了成本和劳动时间,还降低了样本污染的风险和假阳性的概率。以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。


    蚂蚁淘 2018-07-31
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