【讨论】关于重组蛋白生产用的细胞株构建与培养工艺开发

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2021-07-28

问题描述：

经战友同意，将与交流的内容贴出。

您好，
看到您在论坛中的留言，有几个问题想请教一下。
1、一般情况下，反应器中的产量会比摇瓶中的产量提高多少？
2、在培养基优化过程中，一般会有怎样的指导原则？（我在优化培养基时，随意性很大没有明确目标）
3、关于大豆蛋白胨水解多肽在以后的工艺开发中会不会被淘汰掉（近10年）？
4、目前国内的抗体表达水平是多少？我们明年的任务是4G/L，不知道压力是不是很大。（今年是3g/l左右）
期待您的解答……
谢谢！

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laorentou

用户

horizon801 wrote:经战友同意，将交流内容贴出你好，请问关于稳定细胞株所用载体问题：1、现在GS载体是否具有比DHFR有优势，相关专利大约什么时候到期？ GS相对DHFR而言具有以下几点优势：1，细胞株筛选时间短，不需要不断的加压筛选。2，在细胞株稳定性问题上，GS系统要更加稳定，一般稳定性培养都要做到3个月左右时间。GS的专利好像还没有到期，DHFR的专利到期了。现在的筛选系统趋向于GS和DHFR双筛选系统，目的是集合两种优点，但效果还不确定。2、稳定细胞株在使用过程中的产量衰减问题是如何解决的，用大量的稳定细胞株长期加压筛选？细胞株克隆不稳定主要是克隆选择不好或筛选系统不好，主要偏向于前者。细胞株稳定性一般培养到两个月以后降低15%左右还是可以接受的3、如果采用定点整合载体，如何选择？这种方法目前常规用的可能比较少，在这方面没有经验的。一般GS或DHFR系统筛选到高表达细胞株克隆的概率是5%左右.

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liuzy1974

用户

展开引用horizon801经战友同意，公开问题：您好，我看了您的几个帖子，觉得您非常厉害，很是佩服。因为面临毕业找工作处于迷茫期，因此想请教您几个问题：1.我14年硕士毕业，生物化学与分子生物学，女生。不知道我这种情况适不适合去工厂的细胞培养，主要是我是女生，觉得大型反应器应该是男生比较擅长。可能女生没有什么升职的空间。2.在生物制药中有很多的环节，比如细胞，蛋白表达，纯化，您觉得做哪种工作更容易受到重视呢或更容易受到提拔（10年以后可以进入高层）3.是去外企还是国内大企业还是去小企业比较好？我想象中大企业只能接触到某一小部分，小企业是不是可以学到更多的东西，不知道对不对。很期待您的解答，您的解答决定着小女子的方向。谢谢您。期待。。。。......1、可以出国读博士，毕业先到美国小的生物公司先做做2、国内做培养、发酵研发可以去公司的研发机构，大型反应器如果您不是女汉子，就别去。3、生物制药目前缺的是那种国际化的、有工作能力的年轻人，提高表达量、提高纯化收率、等给公司带来明确效益的，还有分析方法开发的人员比较抢手。4、去合资和外企，对于研发来讲比较好，如果你是一个事业型的女孩子，如果你满足于生活的悠闲，可以去研究所，据我所知，研究所往往没有生产型企业的研发搞的更实用，往往偏理论5、小企业或者是发展中的企业可以学习到很多，国外大企业也好，钱多，范围窄，适合没有太多追求的女孩子

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tanjianerge

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心朗朗各位大侠，我请教个很基础的问题（我主要做行政管理这一块），公司细胞培养这块的同事，每天去看发酵罐的次数也就2-3次，这个频率是不是少了点？而且主要的是细胞还养得不怎么样。呵呵，看的次数多少和细胞养的好坏没有必然联系的所以做管理的不要从看发酵罐的次数来做判断，看的次数多少和你的管理工作没有关系，可以随他去细胞养得好不好才是你该关心的事情，养得不好可以说，可以提，但是不能从看多少次发酵罐来入手

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horizon801

用户

1、关于乳酸的控制控制有哪些比较好的策略，根据以往的经验就是就是降低糖浓度，结果是有的时候管用有的时候不管用，对于下面的工艺开发就比较头疼了。2、能否推荐一下关于反应器及工艺优化方面的介绍书籍，增加自己对这方面认识。再次谢谢您

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horizon801

用户

1.我个人的经验的，反应器产量有了过程参数的精确控制（pH/DO/temp），流加方案的优化，关键代谢指标的控制（糖、乳酸、谷氨酰胺、氨），应该有较大幅度的提高（30%），当然这个是casebycase的，不能一概而论，更多的依赖于细胞株潜力和平台化的培养工艺开发效率。2、培养基优化的常规方法与思路（参考《用于重组抗体生产的细胞大规模培养工艺开发》）3、不仅大豆水解物，还有小麦水解物，酵母水解物，肯定是要淘汰的。这些添加物本身成分不明确，质量不可控。培养基的发展方向是CD，即化学成分明晰。4、目前国内新上项目应该在2g/L左右。如果不考虑具体的品种，市场容量对产能的要求。个人感觉4g/L没有必要。重组抗体的产业化工艺开发不仅是细胞培养这一个环节。TITER过高对于下游的压力。对于产品质量的影响，都应该考虑。版主zhulikou431留言:加分鼓励。

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horizon801

用户

1）控制乳酸，首先应考虑葡糖糖的限制性流加策略，即根据细胞的葡萄糖消耗速率进行培养基流加。考虑到葡萄糖浓度控制过低（<1g/L）时，培养基中其他营养成分可能消耗殆尽，一般残糖的控制水平可以控制在2-5g/L左右。目前商品化的培养基及流加策略，都有可供参考的protocal，可以直接在此基础上进行工艺优化。文献中报道的乳酸阈值（影响细胞生长、抗体质量的乳酸浓度）58mM，l流加培养操作模式下，一般很少能达到。其次，细胞培养工艺中pH的控制，对乳酸的生成也有影响。一般情况下，pH控制高，即偏碱的环境是刺激细胞产酸的。所以一般表达重组蛋白的培养工艺中，生产期的pH要控制的偏酸性。最后，溶氧不足也会造成细胞无氧呼吸，代谢产酸的。至于报道的使用半乳糖替代葡萄糖，不做推荐。2）细胞培养的参考书籍推荐huweishou《CellCultureTechnologyforPharmaceuticalandCell-BasedTherapies》google可以查到免费电子版本。

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zhy8811r

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不错，学习了

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六年一世

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学习了！另外询问一个问题，反应器中溶氧不足是培养过程中某个特定阶段的问题呢，还是会伴随整个培养过程一直出现？

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david2846

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horizon8012）细胞培养的参考书籍推荐huweishou《CellCultureTechnologyforPharmaceuticalandCell-BasedTherapies》google可以查到免费电子版本。胡教授的书推荐，听过胡教授的讲座，很有价值~

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david2846

用户

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horizon801

用户

六年一世学习了！另外询问一个问题，反应器中溶氧不足是培养过程中某个特定阶段的问题呢，还是会伴随整个培养过程一直出现？以下是个人浅见，未必正确，仅供参考。1、溶氧需求是个变化的过程完整的细胞培养过程（无论batch、FedBatch还是Prefusion）中溶氧的需求应该是一个变化的过程。因为，从细胞接种后，发酵罐的细胞总数、代谢活力会逐渐增加。此时耗氧量会逐步上升。当进入蛋白表达期后，通常由于降温的作用，细胞进入稳定期不再增殖，耗氧量日趋平缓，甚至下降。以上过程，如果使用三角瓶或简单的一次性反应器（如WAVE20/50）批式培养，溶氧值的变化，会更为直观的体现出来：先下降后稳定，最后稍显升高。2、DO的绝对值不重要、DO的变化才是关键动物细胞对氧气的比消耗速率可以认为是个常数（当然也受代谢的影响），目前产业化流加培养的细胞密度1-2*10E7/ml，与微生物发酵的细胞密度相比（酵母、大肠等），存在数量级的差距。因此，一般情况下，溶氧的需求不是细胞大规模培养的限速步骤。对于灌注培养，虽然细胞密度相对较高（N*10E8/ml），溶氧需求也可以通过通入空气、氧气的混合气体来满足。以上这些，只要在发酵罐上设定溶氧控制范围，保证氧气钢瓶有足够的分压，便可通过反应器期内部的PID程序实现DO的精确控制（一般60~80%）。值得注意的，DO的剧烈波动会影响细胞的活性、产物的质量。前者是笔者有经验之谈。后者可见大量文献报道，DO对糖基化程度的影响。3、回到初始问题，培养过程中溶氧不足。我觉得是否可以先从反应器上找原因版主zhulikou431留言:加分鼓励。但是哥们，不能回答一个问题加1分啊？你要理解。

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horizon801

用户

经战友同意，公开问题：您好，我看了您的几个帖子，觉得您非常厉害，很是佩服。因为面临毕业找工作处于迷茫期，因此想请教您几个问题：1.我14年硕士毕业，生物化学与分子生物学，女生。不知道我这种情况适不适合去工厂的细胞培养，主要是我是女生，觉得大型反应器应该是男生比较擅长。可能女生没有什么升职的空间。2.在生物制药中有很多的环节，比如细胞，蛋白表达，纯化，您觉得做哪种工作更容易受到重视呢或更容易受到提拔（10年以后可以进入高层）3.是去外企还是国内大企业还是去小企业比较好？我想象中大企业只能接触到某一小部分，小企业是不是可以学到更多的东西，不知道对不对。很期待您的解答，您的解答决定着小女子的方向。谢谢您。期待。。。。

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liuzy1974

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三十年河东，三十年河西，对于不明确的培养基添加物只要不是动物的，目前还都能接受，CD未必是主流

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liuzy1974

用户

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horizon801

用户

感谢liuzy1974回答问题。顶一个！

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六年一世

用户

学习了！那这么看来，溶氧问题的解决一来要靠培养工艺的优化，二来要看反应器自身能否合理、高效的把溶氧分配均匀

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laorentou

用户

1.我14年硕士毕业，生物化学与分子生物学，女生。不知道我这种情况适不适合去工厂的细胞培养，主要是我是女生，觉得大型反应器应该是男生比较擅长。可能女生没有什么升职的空间。个人觉得女生去车间做大型的细胞培养不适合，因为我们现在就在做1000L的生产，这样工作还是男生比较适合。2.在生物制药中有很多的环节，比如细胞，蛋白表达，纯化，您觉得做哪种工作更容易受到重视呢或更容易受到提拔（10年以后可以进入高层）在细胞，蛋白表达，纯化这几个工作中，受重视程度没有差异的。做细胞培养方面平时加班多一些，我们休息的时候细胞没有休息。至于被提拔或进入高层要考自己的努力和周围的工作环境（同样条件元老身份的机会大一些）。3.是去外企还是国内大企业还是去小企业比较好？我想象中大企业只能接触到某一小部分，小企业是不是可以学到更多的东西，不知道对不对。如果你有这样的心志建议你去小公司里发展，这样的机会多些；稍微大一点公司里部门结构基本成熟，学的东西比较局限提拔的机会也少（除非你能力非常的强）。最后说明一下，小公司风险大机会多大公司反之，最后在于你选择。版主zhulikou431留言:鼓励新手。

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horizon801

用户

经战友同意，将交流内容贴出你好，请问关于稳定细胞株所用载体问题：1、现在GS载体是否具有比DHFR有优势，相关专利大约什么时候到期？2、稳定细胞株在使用过程中的产量衰减问题是如何解决的，用大量的稳定细胞株长期加压筛选？3、如果采用定点整合载体，如何选择？

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jack_2

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展开引用laorentou1.我14年硕士毕业，生物化学与分子生物学，女生。不知道我这种情况适不适合去工厂的细胞培养，主要是我是女生，觉得大型反应器应该是男生比较擅长。可能女生没有什么升职的空间。个人觉得女生去车间做大型的细胞培养不适合，因为我们现在就在做1000L的生产，这样工作还是男生比较适合。2.在生物制药中有很多的环节，比如细胞，蛋白表达，纯化，您觉得做哪种工作更容易受到重视呢或更容易受到提拔（10年以后可以进入高层）在细胞，蛋白表达，纯化这几个工作中，受重视程度没有差异的。做细胞培养方面平时加班多一些，我们休息的时候细胞没有休息。至于被提拔或进入高层要考自己的努力和周围的工作环境（同样条件元老身份的机会大一些）。3.是去外企还是国内大企业还是去小企业比较好？我想象中大企业只能接触到某一小部分，小企业是不是可以学到更多的东西，不知道对不对。如果你有这样的心志建议你去小公司里发展，这样的机会多些；稍微大一点公司里部门结构基本成熟，学的东西比较局限提拔的机会也少（除非你能力非常的强）。最后说明一下，小公司风险大机会多大公司反之，最后在于你选择。......版主zhulikou431留言:禁止外邀，下次扣分处理。

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laokei

用户

好贴子，收藏

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horizon801

用户

展开引用horizon801经战友同意，将交流内容贴出你好，请问关于稳定细胞株所用载体问题：1、现在GS载体是否具有比DHFR有优势，相关专利大约什么时候到期？2、稳定细胞株在使用过程中的产量衰减问题是如何解决的，用大量的稳定细胞株长期加压筛选？3、如果采用定点整合载体，如何选择？......占座，这两天回答。

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horizon801

用户

经战友同意，公开其问题：看了您发表的“用于重组抗体生产的细胞大规模培养技术”这篇文章，真是受益匪浅，想有个问题请教您，对于一个全新的CHO细胞株（公司引进），我想开发一种适合它的培养基，目前准备对几种常见的成分已知的培养基进行不同混合，然后再进行优化，筛选出最佳方案。还有一种策略就是选择目前市场上的一些商业化培养基进行筛选，前面一种方法肯定更费时费力，但是感觉优化的空间更大点，不知您的意见如何？还是有其他更好的筛选方法，谢谢！

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horizon801

用户

展开引用horizon801经战友同意，公开其问题：看了您发表的“用于重组抗体生产的细胞大规模培养技术”这篇文章，真是受益匪浅，想有个问题请教您，对于一个全新的CHO细胞株（公司引进），我想开发一种适合它的培养基，目前准备对几种常见的成分已知的培养基进行不同混合，然后再进行优化，筛选出最佳方案。还有一种策略就是选择目前市场上的一些商业化培养基进行筛选，前面一种方法肯定更费时费力，但是感觉优化的空间更大点，不知您的意见如何？还是有其他更好的筛选方法，谢谢！......您的问题非常具有代表性。就中小生物技术公司而言，对于重组蛋白药物开发的介入，往往是从获得稳定细胞系开始的。针对这种情况，笔者的个人建议是这样：1、首先应了解该细胞系的来源、背景。即宿主细胞的生长特性、重组细胞的构建流程。培养基的开发虽然可大幅提高表达水平。但是细胞系的营养需求、生产能力在细胞构建的过程中就已经决定了。这是一个“先天”和“后天”的关系。而且，宿主的营养需求、载体的抗性标记，以及细胞系生产能力与遗传稳定性，这些细节都能为后续培养基开发工作提供依据和思路。2、一般项目交接时，技术方会提供与细胞系配套的培养基。培养基若为对方定制产品，则很可能此该培养基已经是针对细胞系优化后的“个性化培养基”；如果培养基为商品化的通用型培养。则表明培养基尚有继续开发的潜力和必要。此时建议你两种策略：1）直接在培养基中添加营养成分（如水解物、IGF、INSULIN等），如liuzy1974所言，水解物是成本低廉、效果显著的营养添加物。2）针对该细胞系对市售成熟的培养基进行筛选（不推荐厂商，可直接google到）。这部分试验，在三角瓶中批式培养即可看出差异。若其中最优培养尚未达到优化效果。可考虑不同培养基进行混合试验。为减少试验次数、提高试验效率，可使用DOE软件进行试验方案设计。3、如果您有已知配方的一种或多种动物细胞培养。可在此基础上进行系统开发。参阅文章中的方法，可以针对特定细胞系开发其“个性化培养基”，也可以开发供多个细胞系共同使用的“平台化培养基”。

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horizon801

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把以前回答战友的帖子，也放在这里：有一个问题请教各位，在国内的实际生产中，提高抗体产量、改善抗体质量更主要是依赖工艺优化呢，还是寄希望于细胞株、培养基的改良？或者更直白一点，药厂老总更青睐于手下人用哪种方式来优化抗体生产？请大家不吝赐教谈下自己的认识：楼主的问题很具代表性。无论是做biosimilar，还是其他重组蛋白药。大家最关心的是往往是三个方面,蛋白表达量（title）、质量（quality），还有就是进度。1、Title，细胞培养过程中蛋白的表达量是由单个细胞的产物比生产速率（Qp），活细胞密度（IVCD）以及培养时间（Time）三者决定的。即Title=Qp*IVCD*TimeQp代表的是细胞异源表达重组蛋白的能力，它是细胞系构建过程中初筛、复筛的主要技术指标。目前行业内能够用于产业化生产的细胞系，Qp一般可以达到20pg/cell/day以上。构建的细胞是否能够达到这个水平，一般取决与空宿主、载体、筛选通量，筛选策略。IVCD活细胞密度和Time培养时间，一般是初筛得到的重组细胞进行培养基优化、工艺开发时，主要考察的指标。目前行业内细胞使用商品化的培养基（Gibico/hyclone等）悬浮细胞密度一般可达1-3*10E7/ml，生长期5-7day，维持期10day以上。此步为细胞培养的工艺开发，需要借助三角瓶、深度孔板、小型反应器等进行培养基筛选、工艺参数优化。所以，细胞的表达能力一般是细胞系构建工程中就已经决定了。而细胞的培养密度、培养周期则需要在培养工艺开发中进行优化。两者都做好了，抗体的产量自然就有了保证。接着谈下质量。抗体作为四聚体糖蛋白，其生物学活性有赖于其完整的结构和恰当的翻译后修饰。某种角度上说，重组抗体的工艺优化，尤其是做similar，质量比TITER更为重要。目前重组抗体的制备是采用动物细胞异源表达。其制备工艺中无论是克隆筛选、细胞培养还是纯化工艺都会都抗体的质量造成影响。克隆筛选的常用策略是根据蛋白表达量去挑选高表达克隆。这样就会造成表达水平高、但是存在质量变异的克隆会进入下一轮复筛。但是，在克隆筛选环节考察产物的质量，需要借助高通量的分析设备。细胞培养过程中无论是培养基、培养工艺（PH/DO/TIME），甚至搅拌桨的设计都会影响抗体的质量。另外，纯化、制剂过程中，涉及到的buffer条件不恰当也会造成蛋白聚体的产生。目前重组抗体工艺开发中，经常关注的几个质量指标有1、分子量，2、纯度，即，单体、大分子物质（聚体）、小分量物质（降解）的含量3、糖基化修饰（寡糖类型及分布，如GO/G1F/G2F/MAN5等4、等电点。

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laorentou

用户

horizon801wrote:经战友同意，将交流内容贴出你好，请问关于稳定细胞株所用载体问题：1、现在GS载体是否具有比DHFR有优势，相关专利大约什么时候到期？GS相对DHFR而言具有以下几点优势：1，细胞株筛选时间短，不需要不断的加压筛选。2，在细胞株稳定性问题上，GS系统要更加稳定，一般稳定性培养都要做到3个月左右时间。GS的专利好像还没有到期，DHFR的专利到期了。现在的筛选系统趋向于GS和DHFR双筛选系统，目的是集合两种优点，但效果还不确定。2、稳定细胞株在使用过程中的产量衰减问题是如何解决的，用大量的稳定细胞株长期加压筛选？细胞株克隆不稳定主要是克隆选择不好或筛选系统不好，主要偏向于前者。细胞株稳定性一般培养到两个月以后降低15%左右还是可以接受的3、如果采用定点整合载体，如何选择？这种方法目前常规用的可能比较少，在这方面没有经验的。一般GS或DHFR系统筛选到高表达细胞株克隆的概率是5%左右.

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laokei

用户

有没有涉及到抗体药物申报中，从一个项目开发开始，应该是一个什么样的流程，中间要注意哪些环节关键点：比如到了什么阶段生产需要某种检测的样品

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houjinglhy

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好帖子mark一下学到很多

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afhgd

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不错，学习

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心朗朗

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各位大侠，我请教个很基础的问题（我主要做行政管理这一块），公司细胞培养这块的同事，每天去看发酵罐的次数也就2-3次，这个频率是不是少了点？而且主要的是细胞还养得不怎么样。

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tanjianerge

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心朗朗

用户

谢谢！

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荡猪的秋千71

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受教了

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zhouxb

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学习了，4g/L算是很高了吧。我刚开始接触这方面，以后多多学习。

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horizon801

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cpu随风而逝wrote:如题，小弟最近在做电荷异构体相关研究，大家都知道希望自己的样品更加呈均一性，减少电荷异构体。尤其在做BIOSIMILAR..更加需要对这些参数进行控制，趋向于和原研药一致。但一个控制范围的把握是很重要的，我想要了解下电荷异构体对质量的影响，比如说药效，免疫原性方面的，本人已经找了很久，请教各位是否有看到类似文章？不甚感激1、抗体分子的异质性与电荷变异抗体分子作为复杂的四聚体糖蛋白，具有质量不均一的特点，即“异质性"。异质性可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径，（如细胞系及培养工艺影响糖基化）也可能来于纯化，制剂工艺中产生降解或聚体。这种异质性也可以宏观表现为：在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带；离子交换色谱图主峰前后出现小峰。这是由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性，所以，这种现象也被称为抗体的电荷变异。2、抗体电荷变异对其药效学的影响目前普遍认为抗体电荷变异对其药效学影响并不显著。基因泰克公司曾对上市抗体及临床前抗体药物做过一个总结。得出的结论是：1）当电荷变异超过一个pH单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学。2）增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除。3）降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清除。（EffectsofChargeonAntibodyTissueDistributionandPharmacokinetics，见附件）3、影响电荷变异的因素及避免方法目前的研究发现：多种化学修饰都会引起重组抗体等电点的改变，如：脱酰胺化、唾液酸化、重链C段赖氨酸清除会造成重组抗体的带正电荷；赖氨酸/甘氨酸酰胺化反应、甲硫氨酸氧化作用等会造成重组抗体带负电荷[85]。针对细胞培养环节，提高培养基中Cu2+浓度，降低Zn2+浓度，可以增强重组抗体C端脯氨酸的酰胺化，最终导致重组抗体发生碱性电荷变异。[86][87]4、参考文献[85]KhawliLA,GoswamiS,HutchinsonR,etal.Chargevariantsinigg1:Isolation,characterization,invitrobindingpropertiesandpharmacokineticsinrats.MAbs,2010,2(6):613-624[86]KaschakT,BoydD,LuF,etal.Characterizationofthebasicchargevariantsofahumanigg1:Effectofcopperconcentrationincellculturemedia.MAbs,2011,3(6):577-583[87]LuoJ,ZhangJ,RenD,etal.Probingofc-terminallysinevariationinarecombinantmonoclonalantibodyproductionusingchinesehamsterovarycellswithchemicallydefinedmedia.Biotechnologyandbioengineering,2012,109(9):2306-2315参考文献下载链接：求电荷异构体对抗体质量的影响的讨论-蚂蚁淘论坛

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horizon801

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某战友PM，个人觉得这个问题挺有代表性的。请教您好！有个问题请教一下，抗体药物在研发、细胞构建、小试、中试、临床这些阶段需要关注哪些法律法规？希望能些好的建议，万分感谢！祝新年快乐！一直以为，熟悉、掌握生物制药开发的相关政策法规，应该是从事此方面研究的技术人员应具备的基本素质。但是，受精力、专业知识所限，自已也没有进行过系统的学习。所以单独开贴，将自己学习的体会附上。也请战友结合业内的案例分析，探讨下这些政策法规的意义，要求。主要的指导原则见国家药审中心网站（但是并不全）http://www.cde.org.cn/zdyz.do?method=initValue&frameStr=0#top

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horizon801

用户

（2）主细胞库(MCB)取原始细胞库细胞，通过一定方式进行传代、增殖后均匀混合成一批，定量分装，保存于液氮或-130℃以下。这些细胞必须按其特定的质控要求进行全面检定，应合格。主细胞库用于工作细胞的制备，每个生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。——生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程horizon801你好，刚才看了《一般指导原则》其中提到（……基质制备及检定规程），里面这句话不是很理解的。能帮忙解释一下吗？谢谢！楼上战友的问题多么的“似曾相识”啊！呵呵，工作中也曾和同事讨论过这个问题。谈下个人看法：1、主细胞库为什么会出现两个细胞代次？一般情况下，重组细胞株构建及建库的过程中。原始细胞株通常要保存十余只冻存管。主细胞库通常保存数十只冻存管。工作细胞库会保存数百只冻存管。根据经验，每只冻存管中细胞总数约1.5-2×10E7cell。如果，细胞传代到某一代次，所有的细胞总数不能满足冻存需要（1.5-2×10E7cell/只×主细胞库冻存管数）。则可能合并两个代次的细胞，构建主细胞库。但是，根据工作经验，这种情况出现的几率太小了。因为上一代的细胞，都用作传代。即便是有用来“保种”的细胞，它也不能称之为上一代细胞。除非，同时复苏了两只冻存管，一支传到N代次，一支传到N+1次。为满足主细胞库冻存细胞总数需要。合并两个代次的细胞。2、主细胞库为什么不能超过两个代次？目前用作宿主的动物细胞都具有“永生性”，如杂交瘤，CHO。但是，为保证重组细胞的遗传稳定性，无论种子细胞（主细胞库、工作细胞库）都有一个明确的代次限定。并且，要经过“遗传稳定性”试验证明，在上述代次范围内，细胞株的诸多表型（如蛋白质量，蛋白表达水平等）基本稳定，趋于一致。目前已业内主流的悬浮细胞培养工艺，从一个冻存管，到发酵终点（20，000L反应器）细胞可能要扩增60-90代。为了保证终端产品的质量稳定性，最简单的办法就是，从细胞株源头保证种子细胞的一致性。所以，监管部门确定，主细胞库的细胞来源，最多不超过两个代次。其实，业内都是普遍自觉的，使用一个代次的种子细胞构建主细胞库。版主zhulikou431留言:加分鼓励。

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willcreater

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求教QpTimeTitleIVCD属于哪个领域，以前做蛋白时接触过一个表格里面有一个值是IVC，老板说是一个积分用来计算每个细胞的工效的（每个细胞干了多少活），没有深究，请Horizon801给扫个盲，求相关理论和书籍，谢谢。展开引用horizon801wrote把以前回答战友的帖子，也放在这里：有一个问题请教各位，在国内的实际生产中，提高抗体产量、改善抗体质量更主要是依赖工艺优化呢，还是寄希望于细胞株、培养基的改良？或者更直白一点，药厂老总更青睐于手下人用哪种方式来优化抗体生产？请大家不吝赐教谈下自己的认识：楼主的问题很具代表性。无论是做biosimilar，还是其他重组蛋白药。大家最关心的是往往是三个方面,蛋白表达量（title）、质量（quality），还有就是进度。1、Title，细胞培养过程中蛋白的表达量是由单个细胞的产物比生产速率（Qp），活细胞密度（IVCD）以及培养时间（Time）三者决定的。即Title=Qp*IVCD*TimeQp代表的是细胞异源表达重组蛋白的能力，它是细胞系构建过程中初筛、复筛的主要技术指标。目前行业内能够用于产业化生产的细胞系，Qp一般可以达到20pg/cell/day以上。构建的细胞是否能够达到这个水平，一般取决与空宿主、载体、筛选通量，筛选策略。IVCD活细胞密度和Time培养时间，一般是初筛得到的重组细胞进行培养基优化、工艺开发时，主要考察的指标。目前行业内细胞使用商品化的培养基（Gibico/hyclone等）悬浮细胞密度一般可达1-3*10E7/ml，生长期5-7day，维持期10day以上。此步为细胞培养的工艺开发，需要借助三角瓶、深度孔板、小型反应器等进行培养基筛选、工艺参数优化。所以，细胞的表达能力一般是细胞系构建工程中就已经决定了。而细胞的培养密度、培养周期则需要在培养工艺开发中进行优化。两者都做好了，抗体的产量自然就有了保证。接着谈下质量。抗体作为四聚体糖蛋白，其生物学活性有赖于其完整的结构和恰当的翻译后修饰。某种角度上说，重组抗体的工艺优化，尤其是做similar，质量比TITER更为重要。目前重组抗体的制备是采用动物细胞异源表达。其制备工艺中无论是克隆筛选、细胞培养还是纯化工艺都会都抗体的质量造成影响。克隆筛选的常用策略是根据蛋白表达量去挑选高表达克隆。这样就会造成表达水平高、但是存在质量变异的克隆会进入下一轮复筛。但是，在克隆筛选环节考察产物的质量，需要借助高通量的分析设备。细胞培养过程中无论是培养基、培养工艺（PH/DO/TIME），甚至搅拌桨的设计都会影响抗体的质量。另外，纯化、制剂过程中，涉及到的buffer条件不恰当也会造成蛋白聚体的产生。目前重组抗体工艺开发中，经常关注的几个质量指标有1、分子量，2、纯度，即，单体、大分子物质（聚体）、小分量物质（降解）的含量3、糖基化修饰（寡糖类型及分布，如GO/G1F/G2F/MAN5等4、等电点。......

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