细胞凋亡的定性检测依赖于形态学观察及DNA电泳,其定量检测则需借助于流式细胞检查。使用碘化丙啶(PI)染色检测DNA含量是最早出现的凋亡定量检测方法［1］。进入90年代,检测DNA断裂点的TUNEL(Terminaldeoxylnucleotidyltransferasemediated-dUTPnickendlabeling)技术成为凋亡定量检测的主流。1995年Vermes首次使用荧光素标记的膜联蛋白V(FITC-AnnexinV)联合PI染色双参数技术定量检测凋亡，目前国内尚未见报道［2］。我们同时使用上述3种方法对地塞米松处理的小鼠胸腺细胞进行凋亡检测对比研究，借以探讨这一新的方法的应用价值，现报道如下。 1 材料与方法 1.1 材料 4周龄雄性昆明小鼠12只。PI(Sigma)。TUNEL试剂盒(德国BoehringerMannheim)。AnnexinV/PI试剂盒(法国国际免疫公司)。流式细胞仪(FACScan型美国BD公司)。 1.2 方法 1.2.1 动物模型及细胞制备 10只小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg，2只小鼠腹腔注射生理盐水作为对照。10h后取胸腺，网搓法分离胸腺细胞。PBS洗2遍后调细胞浓度2×106ml-1，备用。 1.2.2 PI染色法 取2×106细胞,加入80%冷乙醇，4℃30min，PBS洗1次，加入PI50mg/ml，0.1%TritonX-100，0.1mmol/LEDTA(Na)2，RNase50μg/ml。置黑暗处1h后检测。 1.2.3 TUNEL法 取2×106细胞，1%多聚甲醛冰上固定15min,离心去上清,70%冷乙醇固定24h。然后按试剂盒说明操作。 1.2.4 AnnexinV/PI法 取490μl细胞加入5μlFITC-AnnexinV及5μlPI(浓度250μg/ml)，混匀置冰浴暗处温育10min，PBS洗2遍，上机分析。 1.2.5 流式细胞仪分析 光源为488nm氩离子激光器，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光,每份标本收集10000个细胞,然后在Macintosh650计算机上用相关软件分析数据,用HP-Deskjet1600CM打印机打印结果。 2 结果 2.1 PI检测法 在正常二倍体细胞DNA峰(G1峰)前出现一亚二倍体凋亡峰,称Ap峰(图1)。 2.2 TUNEL检测法 根据FITC-dUTP掺入量的多少区分正常及凋亡细胞(图2)。 2.3 FITC-AnnexinV/PI检测法 正常细胞FITC及PI均低染(FITC-PI-)，在流式细胞分析图上为R1区细胞簇。凋亡细胞FITC高染而PI低染(FITC+PI-)，图上显示为R2区细胞簇。死亡细胞FITC及PI均高染(FITC+PI+)，图上显示为R3区细胞簇(图3)。 图1 PI染色法胸腺细胞FACS测定图 Fig.1 CytometricdiagramofPIstainingofmousethymocytes 图2 TUNEL法胸腺细胞FACS测定图 Fig.2 FlowcytometricdiagramofmousethymocytesusingTUNELassay Note:Apeak.normalcells;Bpeak.apoptoticcells 图3 AnnexinV/PI双参数法胸腺细胞FACS测定图 Fig.3 FlowcytometricdiagramofAnnexinV/PIstainingofmousethymocytes Note:Apeak.normalcells;Bpeak.apoptoticcells+necroticcells;Cpeak.normalcells+apoptoticcells;Dpeak.necroticcells;R1.normalcells;R2.apoptoticcells;R3.necroticcells 2.4 PI、AnnexinV/PI、TUNEL3种方法凋亡检出率对照组分别为0、13.12%、1.24%。地塞米松处理组分别为27.19%、32.28%、50.17%,三者之间均有显著差异(P＜0.01),AnnexinV/PI法死亡检出率13.25%,其凋亡+死亡检出率为45.62%,与TUNEL法凋亡检出率无显著差异(P＞0.05)。 2.5 相关分析发现TUNEL法凋亡检出率与AnnexinV/PI法凋亡检出率两者相关系数0.63,P＜0.05，与AnnexinV/PI法凋亡＋死亡检出率二者相关系数为0.7,P＜0.05。 3 讨论 近年来有关凋亡信号转导、基因调控等方面的研究已取得重大进展,但作为所有研究基础的凋亡定量检测技术却进展不大。选用何种凋亡检测技术已成为研究的关键。 凋亡定量检测常需借助流式细胞检查。最早出现且较为常用的流式细胞凋亡定量检测技术是PI染色法。细胞凋亡时DNA断裂成小片段，当细胞用乙醇、TrionX-100处理后，这些小片段从细胞内释放出来，使其DNA含量低于正常细胞的二倍体。用DNA结合染料PI染色后分析，可在G1峰前出现一亚二倍体峰即Ap峰。根据Ap峰的百分率可检测凋亡细胞数。在本组研究中PI法凋亡检出率为27.19%,显著低于TUNEL法及AnnexinV/PI法。其检出率低的原因主要是凋亡早期尽管有DNA裂点形成，但尚未出现DNA片段的大量丢失，因此该法不能检出早期凋亡细胞。次要原因是发生于S期或G2/M期的凋亡细胞，即使有DNA含量降低，其实际含量也不低于二倍体细胞所含的DNA。国内李莉报道采用与本文同一动物模型PI漏检率高达42.8%。此外PI法还存在错检，一部分坏死细胞碎片发生低荧光，位于二倍体峰前，造成PI法错检。据李莉报道错检率达21.3%，因此我们认为PI染色定量检测凋亡并不理想。 目前国内外最为常用的凋亡定量检测方法是检测DNA断裂点的TUNEL法。在TDT作用下将FITC-dUTP掺入DNA裂点的3′-OH端上，根据其掺入量的多少计算凋亡细胞百分比。由于DNA断裂发生在凋亡早期，因此该法可检出早期凋亡细胞，具有较高灵敏性。但该法最大缺点是坏死细胞亦呈现TUNEL反应阳性，使其特异性降低［3］。本研究TUNEL凋亡检出率为50.17%，显著高于其它二法。我们认为这既与其较高的灵敏性有关亦与其较低的特异性有关。为证实此点我们作了进一步研究,结果发现TUNEL凋亡检出率与AnnexinV/PI中凋亡＋死亡检出率无显著差异，相关分析亦提示TUNEL凋亡检出率实际更能反映凋亡＋死亡检出率。 1992年Fadok报道在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸(PS)迁移至细胞外侧［4］。1995年Vermes利用对PS有高度亲合力的磷脂结合蛋白AnnexinV检测凋亡细胞。由于坏死细胞PS亦暴露于外表使AnnexinV结合阳性，因此必须同时采用PI这一坏死细胞染色阳性的DNA染料将坏死细胞区分出来。与PI法检测凋亡不同的是该法不需要固定细胞，因此凋亡细胞PI低染。本资料表明使用AnnexinV/PI双参数法可将正常细胞、凋亡细胞、死亡细胞区分开来，其凋亡检出率更有特异性。细胞发生凋亡时膜上PS外露早于DNA断裂发生［2］，因此该法检测早期凋亡优于TUNEL法及PI法。现已明确胸腺细胞可自发发生凋亡［5］，但本资料对照组PI法未检出凋亡，TUNEL法检出率仅为1.24%，而AnnexinV/PI法检出率13.12%,这亦证实该法可检出早期凋亡因而具有更大的灵敏性。该法另一优点是细胞不需要固定，避免了PI法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此更加省时，结果亦更为可靠。 综上所述,我们认为AnnexinV/PI法既可检测早期凋亡,又可将凋亡及死亡细胞区分开来，较PI、TUNEL具有更高的灵敏性及特异性。且不需固定，省时省力，应是目前流式细胞仪定量检测凋亡的首选方法。 作者简介：郑骏年，男，32岁，泌尿外科硕士； 指导教师，谢叔良，男，教授，从事肿瘤及移植耐受研究 参考文献 1 NicolettiI,MiglioratiG,PagliacciMC.Arapidandsimplemethodformeasuringthymocyteapoptosisbypropidiumiodidestainingandflowcytometry.JImmunolMethods，1991;139:271 2 VermesI,HaanenC,Steffens-NakkenHetal.Anovelassayforapoptosis.FlowcytometricdetectionofphosphatidylserineexpressiononearlyapoptosiscellsusingfluoresceinlabeledAnnexinV.JImmunolMethods，1995;184:39 3 GorczycaW,GongJP,DarzynkiewiczZ.DetectionofDNAstrandbreaksinindividualapoptoticcellsbytheinsituterminaldeoxynucleotidyltransferaseandnicktranslationassay.CancerRes，1993;53:1945 4 FadokVA,VoelkerDR,CampbellPAetal.Exposureofphosphatidylserineonthesurfaceofapoptoticlymphocytestriggersspecificrecognitionandremovalbymacrophage.JImmuol，1992;148:2207 5 郭爱珍.胸腺细胞的发育与凋亡.细胞与分子免疫学杂志，1997；13(1):61
