10X Genomics单细胞转录组技术流程和优势
导读
本研究基于10xGenomics微流体芯片技术，采用单细胞转录组测序，较好的在转录水平上描述了多能性细胞培养中体现出的细胞态异质性。根据细胞不同的多能状态，研究人员将18,787个WTCCRISPRi人诱导多能干细胞分为四个亚群，并确定了定义每个亚群的新基因和通路，开发出一个用于单细胞精确亚群分类的多基因预测模型。该研究为我们提供了目前最大的关于未分化的人诱导多能干细胞的单细胞转录表达谱数据库，包含5个生物复制子的18,787个细胞的研究数据，增加了我们对多能细胞复杂性的理解。
10x单细胞技术优势
基于10xGenomics平台的单细胞转录组测序，通过微流体芯片将单个细胞分配到单个油包水液滴中，在单个液滴中进行反应。同时可以获得1000-10000个细胞的表达信息，从而实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测，是肿瘤细胞异质性、免疫细胞群体检测以及胚胎发育研究的黄金方法。
转录组是细胞表型的关键决定因子，以往通过对大量细胞进行平均测量来了解细胞转录组的结构和功能的研究方法掩盖了细胞间的可变性，阻碍我们在分子层面上确定异质性的本质。但是任何组织或细胞培养中细胞间的差异是其生物状态和功能的基本特征，这是理解生物复杂性的基础。
多能干细胞研究现状
多能干细胞具有无限的自我更新能力，可以根据转录网络的逐步变化而产生专门的细胞类型。转录网络可以调控细胞从多能状态转变为分化状态。已发表的人诱导多能干细胞和人胚胎干细胞数据，包括转录表达谱，基因组序列和表观遗传分析，为细胞系研究提供了广泛的表型特征数据，在功能基因组学研究方面具有参考价值，但是对研究代表多能性的细胞异质性却缺乏关键洞察力。
虽然转录表达谱是分析多能性的中心点，然而目前研究并未对多能性培养细胞异质性在转录水平上进行描述。基于每个细胞都有独特的表达状态，包括特定的调控因子和目标基因行为，scRNA-seq为研究个体细胞功能多能性提供了转录水平上的理解并体现了包括多能态在内的转录异质性。
本研究提供了目前最大的关于未分化的人类诱导多能干细胞的单细胞转录表达谱数据库，该数据库包含5个生物复制子的18787个细胞的研究数据。在此基础上，作者提出以下推论：（1）单细胞层面的转录水平能够揭示调节特定细胞亚群的基因网络；（2）转录本能够表现细胞特定亚群间基因表达异质性的差异；（3）多能细胞是基于生物过程或分化潜能形成不同组织或细胞亚群的。
研究策略
研究结果
1.基于生物功能鉴定四个hiPSC亚群
采用无监督无偏好的分类方法，根据全基因组转录组配置将细胞定量分配成簇，并鉴定为四种独立的细胞亚群，分别占总细胞的48.3%，47.8%，2.8%和1.1%。
单细胞转录表达谱分析揭示了由它们的细胞多能性、细胞增殖、细胞谱系固有潜能所定义的4个亚群。亚群1的多能性细胞代表静止的多能态，亚群2代表增殖性多能细胞，亚群3代表早期分化细胞，亚群4代表晚期分化细胞。
2.根据转录表达谱预测细胞分类
根据筛选所得的差异表达基因，作者建立了鉴定单细胞多能性潜能的无偏好预测模型。采用变量选择回归模型LASSO估计区别集群的基因效应。采用100-foldbootstrapping评估四个种群细胞的预测准确性。结果显示，细胞亚群3和4与其余大多数细胞群的差异更大，进一步说明亚群3和4比亚群1和2更容易分化。
作者从人类诱导多能干细胞研究（HipSci）中获得了来自于正常个体皮肤的71个hiPSClines的开放RNA-seq转录计数数据（tags/million-tpm），进一步证实单细胞测序数据准确反映了转录本的相对丰度。
3.转录异质性显示细胞亚群的特异性
作者在18787个单细胞的大规模数据集和检测到的16000余个基因研究基础上对不同基因、不同亚群和不同细胞的表达变化进行了分析。发现在scRNA-seq数据中，基因表达的固有高异质性，特别是对于具有频繁开关信号的低丰度基因，可能会降低不同亚群细胞间差异表达分析的检测能力。作者发现细胞越少的亚群基因变异越多，且低表达基因变异越多。指定亚群细胞与其他亚群基因表达的异质性水平差异是亚群相对动态细胞活动的一个重要指标。
doi:https://doi.org/10.1101/119255
doi:https://doi.org/10.1101/119255导读
本研究基于10xGenomics微流体芯片技术，采用单细胞转录组测序，较好的在转录水平上描述了多能性细胞培养中体现出的细胞态异质性。根据细胞不同的多能状态，研究人员将18,787个WTCCRISPRi人诱导多能干细胞分为四个亚群，并确定了定义每个亚群的新基因和通路，开发出一个用于单细胞精确亚群分类的多基因预测模型。该研究为我们提供了目前最大的关于未分化的人诱导多能干细胞的单细胞转录表达谱数据库，包含5个生物复制子的18,787个细胞的研究数据，增加了我们对多能细胞复杂性的理解。
10x单细胞技术优势
基于10xGenomics平台的单细胞转录组测序，通过微流体芯片将单个细胞分配到单个油包水液滴中，在单个液滴中进行反应。同时可以获得1000-10000个细胞的表达信息，从而实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测，是肿瘤细胞异质性、免疫细胞群体检测以及胚胎发育研究的黄金方法。
转录组是细胞表型的关键决定因子，以往通过对大量细胞进行平均测量来了解细胞转录组的结构和功能的研究方法掩盖了细胞间的可变性，阻碍我们在分子层面上确定异质性的本质。但是任何组织或细胞培养中细胞间的差异是其生物状态和功能的基本特征，这是理解生物复杂性的基础。
多能干细胞研究现状
多能干细胞具有无限的自我更新能力，可以根据转录网络的逐步变化而产生专门的细胞类型。转录网络可以调控细胞从多能状态转变为分化状态。已发表的人诱导多能干细胞和人胚胎干细胞数据，包括转录表达谱，基因组序列和表观遗传分析，为细胞系研究提供了广泛的表型特征数据，在功能基因组学研究方面具有参考价值，但是对研究代表多能性的细胞异质性却缺乏关键洞察力。
虽然转录表达谱是分析多能性的中心点，然而目前研究并未对多能性培养细胞异质性在转录水平上进行描述。基于每个细胞都有独特的表达状态，包括特定的调控因子和目标基因行为，scRNA-seq为研究个体细胞功能多能性提供了转录水平上的理解并体现了包括多能态在内的转录异质性。
本研究提供了目前最大的关于未分化的人类诱导多能干细胞的单细胞转录表达谱数据库，该数据库包含5个生物复制子的18787个细胞的研究数据。在此基础上，作者提出以下推论：（1）单细胞层面的转录水平能够揭示调节特定细胞亚群的基因网络；（2）转录本能够表现细胞特定亚群间基因表达异质性的差异；（3）多能细胞是基于生物过程或分化潜能形成不同组织或细胞亚群的。
研究策略
研究结果
1.基于生物功能鉴定四个hiPSC亚群
采用无监督无偏好的分类方法，根据全基因组转录组配置将细胞定量分配成簇，并鉴定为四种独立的细胞亚群，分别占总细胞的48.3%，47.8%，2.8%和1.1%。
单细胞转录表达谱分析揭示了由它们的细胞多能性、细胞增殖、细胞谱系固有潜能所定义的4个亚群。亚群1的多能性细胞代表静止的多能态，亚群2代表增殖性多能细胞，亚群3代表早期分化细胞，亚群4代表晚期分化细胞。
2.根据转录表达谱预测细胞分类
根据筛选所得的差异表达基因，作者建立了鉴定单细胞多能性潜能的无偏好预测模型。采用变量选择回归模型LASSO估计区别集群的基因效应。采用100-foldbootstrapping评估四个种群细胞的预测准确性。结果显示，细胞亚群3和4与其余大多数细胞群的差异更大，进一步说明亚群3和4比亚群1和2更容易分化。
作者从人类诱导多能干细胞研究（HipSci）中获得了来自于正常个体皮肤的71个hiPSClines的开放RNA-seq转录计数数据（tags/million-tpm），进一步证实单细胞测序数据准确反映了转录本的相对丰度。
3.转录异质性显示细胞亚群的特异性
作者在18787个单细胞的大规模数据集和检测到的16000余个基因研究基础上对不同基因、不同亚群和不同细胞的表达变化进行了分析。发现在scRNA-seq数据中，基因表达的固有高异质性，特别是对于具有频繁开关信号的低丰度基因，可能会降低不同亚群细胞间差异表达分析的检测能力。作者发现细胞越少的亚群基因变异越多，且低表达基因变异越多。指定亚群细胞与其他亚群基因表达的异质性水平差异是亚群相对动态细胞活动的一个重要指标。
doi:https://doi.org/10.1101/119255
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发布于 ： 2017-09-11
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