特殊细胞培养实验一一、二倍体细胞培养法
| 实验方法原理 | 二倍体细胞来源体内二倍体细胞，也即正常细胞的初代培养。初代培养细胞成功后能始终保持二倍体细胞性状，便成为二倍体细胞培养。 二倍体细胞虽不难培养，但欲求长期呈旺盛地增殖生长、并保持二倍体细胞性状，亦非易事。为此必须采取一些有效的措施，一是低温冻存，二是妥善的培养方法。 用反复传代的方法以求获得大量细胞和维持细胞长期生存的办法是不妥的。因在反复传代中，难免由于培养条件的变化和其它不利影响，使细胞生物学性状发生变化。随时间延长不仅能导致细胞停止生长，并可失掉二倍体性状或发生转化。 | ||||||||
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| 实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | 培养液BSS胰蛋白酶消化液 仪器、耗材 | 培养瓶 实验步骤 | 二倍体细胞培养方法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为 1. 吸除旧培养液注入另瓶中； 2. 用BSS冲洗1次； 3. 用0.25%胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖住细胞层即可；作用1~5 分钟； 4. 待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化；为防止细胞丢失可不必再用BSS冲洗，直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1）新旧混合； 5. 轻轻反复吹打制成单个细胞悬液（消化不足或吹打不充分，易形成细胞团，不利于生长，应注意避免）； 6. 按一分为二比例接种培养。 其他 | 一、要点 1. 采取以下措施可能利于二倍体细胞培养 （1）严格控制pH值，最好在5%CO2温箱中培养； （2）换液时间不要间隔太长，且不要全部更新，尽量保留一部分旧培养液，以弃掉1/2或2/3为妥； （3）传代期不能过长，不能让细胞长得过于密集，一旦细胞接近或刚刚连接成片，即进行传代； （4）要选用高质量的培养基和血清，并尽量维持不变，每次传代都按一分为二的原则（细胞数量、营养液量、培养瓶的空间和面积都不得一样）进行培养； （5）传代后如细胞不用于实验，立即低温冻存。 2. 来源于胚胎的二倍体成纤维细胞平均分裂50次左右即进入衰退期。 不同种类和来源的二倍体细胞生存期都不一样，但生存期皆有限。 虽然二倍体细胞具有限的生存期，却完全能满足反复使用的要求。 以成纤维细胞为例，即便从初代接种1个细胞算起，按产生的细胞数=n×2n（n=接种细胞数）计算，它所提供的细胞也近天文数字。而在实际应用上，初代接种的细胞都几十万以上，因此一个二倍体细胞系最终提供的细胞数量近于无限的。 二、讨论 如何能保留有大量可利用的二倍体细胞？首先在初代二倍体细胞培养时，要接种多量细胞；生长成功后立即冻存做为种细胞（Stock）。用于实验时，解冻1分Stock，传1~3代，按下式处理：  据上，可见二倍体细胞是可长期应用的。 |
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发布于 ： 2021-08-01
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