特殊细胞培养实验一单细胞分离培养法
| 实验方法原理 | 从理论上说各种培养细胞都可用以进行克隆培养。但实际上，初代培养细胞和有限细胞系（二倍体细胞）比较困难。无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞等则比较容易。 其原因是，当体内任何细胞被置于体外培养后，对培养环境都有一个适应过程。期间细胞对营养液具有同化作用，即从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物，也有促细胞生长物质。有人称之为化学信使，具有促克隆细胞生长作用，实则为生长因子类物质。 单细胞同化营养液能力不如群体细胞强；初代培养细胞、有限细胞系（二倍体细胞）不如无限细胞系、转化细胞和肿瘤细胞强。转化细胞和肿瘤细胞强的原因，可能与它们有自泌（Autocrine）和内泌（Endocrine），即自己合成生长因子能力有关。 | ||||||||||
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| 实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | Hanks培养液胰蛋白酶 仪器、耗材 | 离心机滤膜 实验步骤 | 一、适应性培养基 1. 培养同源细胞（未克隆前时的同一细胞）至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24~48小时后，吸出所有培养液； 2. 离心 3000~4000/分，离心10分钟后，吸取上清液； 3. 滤过 再经直径0.22μm滤孔的滤膜过滤，低温冻存贮备用；用时取1分适应培养基+2分培养基混合使用。 二、饲细胞 1. 取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按105 细胞/毫升重新接种培养； 2. 在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml的丝裂霉素C（MitomycineC），按2μg/106 细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量30~50戈瑞（Gy）； 3. 细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5×104/ml（104细胞/cm2）接种入新培养基中； 4. 48小时后，即可用于细胞克隆之用。 三、底物特殊处理 1. 制备浓度为1mg/ml的多聚右旋赖氨酸的水溶液，用以湿润培养瓶底； 2. 倒出多聚赖氨酸液，用5mlPBS冲洗一次后，可立即使用，或存数周内使用亦可。 四、适应性底物 1. 纤维蛋白原液 纤维蛋白原液250mg，NaCl800mg，枸橼酸钠25mg，玻璃三蒸馏水1000ml，滤过法灭菌。 2. 向培养皿中先加1ml纤维蛋白原液，然后再续加4ml含有凝血酶原的培养液，迅速用吸管头充分混合，数分钟后便凝集形成一层清晰的胶状膜； 3. 再把细胞接种于此膜之上；也可先把细胞加入到含有凝血酶原的培养液中，在加入纤维蛋白原液后，再让细胞附在胶膜上生长。  注意事项 | 1. 分离适应性培养基时一定要利用处于指数增生期时的细胞。因此时的细胞生长最旺盛，机能活跃，向周围环境释放促生长的物质最多，培养液中营养成分又未被耗尽，是分离制备的最好时刻。刚分离后的适应性培养基中可能含有少量细胞，一定要通过离心和滤过排除干净，以免形成假克隆。 其他 | 一、提高克隆形成率的措施 细胞经过稀释后，在低密度状态下培养时，克隆形成率明显下降，即克隆形成率与细胞的密度成正比。对无限细胞系来说尚无严重影响，它们的克隆形成率一般很少降到10%以下。但初代培养细胞和有限细胞系的克隆形成率则很低，仅有0.5%~5%，甚至为零。因此必须提高细胞克隆形成率才易克隆成功，为此常采取以下一些措施： 1. 培养基 为提高细胞克隆形成率，选择适当的培养基是非常重要的环节，现知以下一些培养基用作克隆时效果可能较好。   以上培养基都是个别研究者选用的，难免有一定的局限性。事实上分散于各实验室的同一种细胞，经过长期培养后，难免发生一些适应性变化。因此同一种培养基也不一定能适用于不同条件下的同类细胞。 |
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发布于 ： 2021-07-30
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