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2018-12-26
Take off Media Trypsinate with 1ml x2 Dulbecco A trypsin Add 7ml Media Pipette up and down to distribute cells throughout media (i.e. not clumped together) Add 查看更多>
菌种保存和微生物常识1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养:从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质,满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础,是生命活动 查看更多>
上海觅拓生物科技有限公司在发布的 ZENOAQCELLBANKER 2(无血清型细胞冻存液)供应信息,浏览与 ZENOAQCELLBANKER 2(无血清型细胞冻存液)相关的产品或在搜索更多与 ZENOAQCELLBANKER 2(无血清型细胞冻存液)相关的内容。 查看更多>
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小生刚开始做细胞培养不久,对于一个细胞培养的新手来说,最怕的就是细胞受污染。所以本人翻阅了一些园子里的关于细胞培养过程中的污染问题的贴子,结合平时查阅资料以及这些天的细胞培养的一些心得,整理出一些关于细胞污染的东东与大家一起分享。希望能对刚踏入细胞培养的同仁们有些帮助,也希望各位达人作出补充,大家共同进步。 概述 凡混入细胞培养环境 查看更多>
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Use of a Hemacytometer A hemacytometer (also spelled hemocytometer) is an etched glass chamber with raised sides that will hold a quartz coverslip exactly 0.1 查看更多>
上海远慕生物科技是家专业从事科研试剂的供应商,专业供应进口/国产elisa试剂盒,质粒载体,培养基,抗体,动物血清血浆,标准品对照品,化学试剂,酶联免疫试剂盒,白介素试剂盒,金标检测试剂盒,微生物,蛋白质,ELISA种属涵盖广,提供ELISA试剂盒免费代测服务,咨询!产品简介:随着实验室细胞培养的发展,除了原代培养之外,人工开发出来的细胞系的保存越来越重要。冷冻保存细胞系的优点如下:1、减少基因漂移;2、减缓细胞系的衰老;3、稳定表型... 查看更多>
赛业(广州)生物科技有限公司在发布的间质干细胞无蛋白非程序冻存液供应信息,浏览与间质干细胞无蛋白非程序冻存液相关的产品或在搜索更多与间质干细胞无蛋白非程序冻存液相关的内容。 查看更多>
Freezing and Thawing of Mammalian Cell Lines For long term storage of myeloma cells, hybridoma cells, T cells, and other mammalian cell lines in liquid nitroge 查看更多>
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冻存管存好 这样子便于试剂在合理的条件下储存 以后还能继续使用哈
corning的冻存管外包装袋子破了,冻存管还能用吗?
细胞冻存、解冻方法与细胞计数
一、细胞冷冻保存
1.材料:
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法:
(1)传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤:
(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。
(3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
(4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
4、注意事项:
(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。
(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如SigmaD-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。
(4)冷冻保存之细胞浓度:
①normalhumanfibroblast:1~3×106cells/ml
②hybridoma:1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherenttumorlines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
④othersUSPensions:5~10×106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backupculture,以防止冷冻失败。
(6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。

二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。
2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤:
(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。
(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。
(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。
(4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。
(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试
1、原理:
(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。
(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料,如果细胞不易吸收trypanblue,则用红色之Erythrosinbluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。
2、材料:
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061);Erythosinbluishstain;取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。
3、步骤:
(1)取50μl细胞悬浮液与50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。
(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注:4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
计数板计数时,最适浓度为5~10×105细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例:
T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液,取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格:55,62,49,59;死细胞数/方格:5,3,4,6;细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75;稀释倍数=2;
细胞数/ml:60.75×104×2(稀释倍数)=1.22×106;
细胞数/flask(10ml):1.22×106×10ml=12.2×106
存活率:225/243﹦92.6%
冻存组织的mirna会不会降解123
腐姐控控06102017-09-29
博陵科为 的 miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green),可检测pg级总RNA中miRNA的单碱基差异 miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒( SYBR Green)中包含miRNA荧光定量检测的所有试剂,包括2×miRcute miRNA premix和Reverse primer。
2×miRcute。
样品进入无菌室的管理123
_DJ___IXfrj°2021-07-29
进入前肯定是要进行消毒的,穿戴好衣服鞋帽,下面给你介绍下一些实验室要注意的安全事项吧。 1、加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均。冻存的试剂更是要等全部融化后才能使用。
本研究是一单基因遗传病的基因连锁定位及突变分析,现采集了外周血标本冻存(已分离出血浆,血细胞冻存-80度),择期拟提取基因组DNA做连锁分析,请问各位同道:用哪个公司的DNA试剂盒最好,谢谢!
不同的菌表现情况不同,做过的大肠杆菌基因工程菌一般不需要平板活化可以直接摇瓶培养,每次的生长情况比较稳定,这样可以简化操作步骤、节省时间和减少染菌几率,是可以尝试的;而有的菌则必须经过平板活化后再摇瓶培养,否则摇瓶培养会出现生长速度会很慢、生长很不稳定等不良状况
一 、细胞表面标记的检测 1.试剂平衡至室温。准备:消毒台面;穿戴工作服,帽子,口罩和手套,放置棉签,草纸和有盖垃圾桶(内装有消毒剂)。 2.写编号纸并编号。1----IgG1/ IgG1/ IgG12----CD4/CD8/CD33----CD14/CD454---- 3.每管加相应的抗体
具体看情况而定,实验室用的晶安生物的。
使用了可靠有效的保护剂恰当冻存的细胞可永远保存在液氮中而保持活力。至少已证明的历史有30-50年了。不管是在液态液氮中,还是在液氮的气相中,过了几十年细胞活力没有明显下降。
  但在干冰或-70℃冰箱中保存的细胞,活力下降很快,当然细胞与细胞之间敏感性不同。有实验验证保存在-70℃冰箱中的细胞6个月后活力损失超过50%。ATCC证明在干冰中人类细胞4个月活力损失殆尽,小鼠的细胞可到6个月。
细胞冻存的方法与步骤 123
央央优耄Iy5M02017-09-29
(一)仪器
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
7. 液氮冰箱
(二)玻璃器皿
1. 吸管(弯头、直头)
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶(250ml、100ml)
4. 废液缸
(三)塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 移液管(10ml)
5. 15ml离心管
6. 冻存管(1~2ml)
(四)其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
3. 记号笔
4. 医用橡皮膏
5. 移液枪
(五)试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培养液
4. 双抗(青霉素、链霉素)
5. 胰蛋白酶(0.08%)
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油 (一)细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;
2. 取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中;
3. 离心1000rpm,5min;
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml;
5. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;
6. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;
7. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。
(二) 细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;
3. 离心, 1000rpm,5min;
4. 弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;
5. 次日更换一次培养液,继续培养。 1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液;
2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤;
3.冻存和复苏最好用新配制的培养液。向左转|向右转
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