Adult bovine serum is pooled into large batches duringprocessing. It is often useful as a biochemical reagent for invitro diagnostics and for some established cell lines. It is notrecommended for hybridomas, embryonic stem cells, or otherfastidious cell types.
Sterile-filtered
Mycoplasma-tested and virus-screened
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1、毕氏酵母氯化锂转化法
(1)试剂1M LiCl(用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释)50% PEG3350(Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌,用较紧的盖子的瓶子分装)2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存注:醋酸锂对毕氏酵母无效,仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用;
(2)感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中,30℃摇菌过夜(约24~28h)培养到OD值为0.8~1.0(约108 Cells/ml);收获细胞,用25ml无菌水洗涤一次,室温下1500g离心10min;重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中,将悬液转入1.5ml离心管;离心机最大速度离心15秒沉淀菌体,重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中;按50ul/管分装,立即进行转化;注:不要将感受态酵母菌冰浴;
(3)毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min,迅速冰浴以制备单链担体DNA;将感受态酵母菌离心,以Tips去除残余的LiCl溶液;对于每一个转化,按以下顺序加入:50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5~10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min);30℃水浴孵育30min;42℃水浴热休克20~25min;6000~8000rpm离心收集酵母菌体;重悬酵母于1ml YPD培养基,30℃摇床孵育;1~4h后,取25~100ul菌液铺选择性培养基平板,于30℃培养2~3天鉴定;
2、毕氏酵母PEG1000转化法
(1)试剂缓冲液A:1.0M Sorbitol,10mM Bicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol缓冲液B:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2M Bicine,pH8.35缓冲液C:0.15M NaCl,10mM Bicine,pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70℃保存注:缓冲液A、B、C均用滤膜过滤,-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化,建议按6样品/组进行);
(2)待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板,30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中,30℃振荡培养过夜;取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养,待其OD值从0.1升到0.5~0.8;室温下3000g离心收集酵母菌体,50ml缓冲液A洗涤一次;重悬菌体于4ml缓冲液A中,按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中,每管加入11ulDMSO,混合后迅速于液氮中冷冻,-70℃保存
(3)毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中,直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得最大转化率;37℃水浴孵育5min,中间混合样品1~2次;取出离心管,加入1.5ml缓冲液B,彻底混匀;30℃水浴孵育1h;室温下2000g离心10min,去除上清液,菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中;离心样品,去除上清液,轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中;将所有转化液铺于选择性平板,于30℃孵育3~4天后,鉴定;
3、毕氏酵母电转化法
(1)E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液,接种于200ml LB液体培养基中活化培养,37℃,200 rpm,16~18小时。取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中。37℃,200 rpm,培养16~18小时。灭菌500 ml离心管,4℃,4000 rpm,20 min。得菌体沉淀。弃上清,菌体用10%甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。第三次离心后,弃绝大部分上清,留下约1ml 液体用于重悬菌体。从制得得感受态细胞中,取200ul于灭菌EP管中,加入连接反应产物5ul,混匀,不要产生气泡,在冰上放置5min。将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。使用电击穿孔仪进行转化,设置为电压 2500 V,时间 5 ms。电击后,往电击杯中加入 800ul SOC培养基,冲洗出菌体,转移至灭菌1.5 ml EP管中。37℃,150 rpm ,轻摇45~60 min。取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB-Zeocin平板上,正放,待涂布液不在流动,37℃ 培养12~16小时。
(2)线性化质粒DNA对Pichia pastorisGS115的转化取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中,使其完全解冻;
1)将100μl菌体移出至一新的无菌Eppendorf管中,加入5-20μg线性化质粒(5~10μl),轻弹混匀,尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中;
2) 转化杯置于冰浴中5~10分钟,保持低温。
3) 电穿孔转化电击条件:电压:1500V;电阻:400Ω;电容:25μF;脉冲时间:10mS;一次电击。
4) 电击后,马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的1M的山梨醇溶液,用微量移液枪吹打均匀,置于冰浴中;5) 取30℃烘至表面半干的MD培养基平板,在超净工作台上无菌操作涂布平板,400μl/板
培养基:1640+10%FBS
消化条件: 预冷PBS浸泡5-10Min
细胞正常形态为圆形,贴壁生长,生长速度较快,细胞难消化,消化时用预冷的PBS淋洗,然后浸泡5min,让后用枪轻轻吹起吹散收集离心,这个过程很关键,如果没有消化到位就吹打或消化过久,细胞次日贴壁就会分化,分化之后的形态是细胞两端长出尖尖的触角,细胞不再圆形贴壁,而是平铺向四周扩散生长。
所以你换培养基试试看,我养的挺好的!
1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;
2. 取对数生长期的细胞,去除旧培养液,用PBS清洗。
3. 去除PBS,加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;
4. 离心1000rpm,5min;
5. 去除胰蛋白酶,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml;
6. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;
7. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;
8. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。
吹打最好还是用弯头的,用起来更为方便
2×miRcute。
1. 37℃水浴预热培养液(HUVEC-004)。
2. 从液氮中取出HUVEC的细胞管,快速将其置入37℃水浴中解冻,直到管中只剩下最后一片结晶(注意:不要让水没过产品管)。 用75%的酒精擦拭产品管外壁。
3. 将HUVEC的细胞管中的细胞移至15ml无菌离心管中,慢慢逐滴加入预温的37℃ 基础培养液(HUVEC-004B)培养液4-5ml混匀,边加边摇匀。
4. 用1ml的培养液冲洗HUVEC的细胞管,向15ml离心管中加入冲洗的细胞悬液,边滴加边摇匀。
5. 取10μl细胞悬液和10μl台盼蓝混匀后,取10μl计数。
这一步骤非常重要,能确定您收到的产品是否合格(详见如何计数复苏的细胞)
6. HUVEC的细胞悬液在1500rpm,室温条件下,离心10分钟,去除上清。
7. 加HUVEC完全培养液4-5ml, 轻轻混匀细胞,备用。
8. 接种前将 T25培养瓶中的包被液吸去,按2500-5000个细胞/cm2接种细胞。(1支冷冻的细胞可以种一瓶T25培养瓶)
9. 每个HUVEC的细胞培养瓶中加完全培养液(HUVEC-004)3-5ml, 后置于37℃、5%CO2 培养箱内培养。
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