FibroblastGrowthFactors,FGFs,area22memberfamilyofproteinsknowntobeinvolvedinangiogenesis,woundhealingandembryonicdevelopment.Asafamily,theybindtoheparinandsignalthroughfourreceptortyrosinekinasescalled,FGFR1,2,3and4.FGF-acidic,orFGF1,isaparticularlypotentinducerofDNAsynthesisandhaschemotacticactivities.RecombinantmouseFGF-acidicisanon-glycosylatedprotein,comprisedof141aminoacidresidueswithamolecularweightof15.9kDa.
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1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;
2. 取对数生长期的细胞,去除旧培养液,用PBS清洗。
3. 去除PBS,加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;
4. 离心1000rpm,5min;
5. 去除胰蛋白酶,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml;
6. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;
7. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;
8. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。
2×miRcute。
一、细胞冷冻保存
1.材料:
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法:
(1)传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤:
(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。
(3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
(4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
4、注意事项:
(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。
(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如SigmaD-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。
(4)冷冻保存之细胞浓度:
①normalhumanfibroblast:1~3×106cells/ml
②hybridoma:1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherenttumorlines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
④othersUSPensions:5~10×106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backupculture,以防止冷冻失败。
(6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。
二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。
2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤:
(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。
(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。
(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。
(4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。
(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试
1、原理:
(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。
(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料,如果细胞不易吸收trypanblue,则用红色之Erythrosinbluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。
2、材料:
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061);Erythosinbluishstain;取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。
3、步骤:
(1)取50μl细胞悬浮液与50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。
(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注:4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
计数板计数时,最适浓度为5~10×105细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例:
T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液,取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格:55,62,49,59;死细胞数/方格:5,3,4,6;细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75;稀释倍数=2;
细胞数/ml:60.75×104×2(稀释倍数)=1.22×106;
细胞数/flask(10ml):1.22×106×10ml=12.2×106
存活率:225/243﹦92.6%
但在干冰或-70℃冰箱中保存的细胞,活力下降很快,当然细胞与细胞之间敏感性不同。有实验验证保存在-70℃冰箱中的细胞6个月后活力损失超过50%。ATCC证明在干冰中人类细胞4个月活力损失殆尽,小鼠的细胞可到6个月。
1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态,约为80 – 90 %致密度。
2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
3. 注意冷冻保护剂之品质,冻存液:10%DMSO+90%FBS,我做细胞试验从不加双抗,NAHCO3-未加
4. 冷冻保存的细胞浓度:
冻存方法
1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。
2.收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。 离心速度不要大于1000rpm/min或800g/min。
3.离心弃上清,加入适量冷冻保存溶液,使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml,混匀,分装于无菌冻存管中,1 ml/vial,悬浮细胞可以浓一些。
4.冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。 或4 oC 1h→ -20 oC 1h→ -80 oC 1h(或隔夜) → 液氮槽vapor phase
最常见的我的k562细胞就是这样做的。
阳离子脂质体法 :稳定转染,瞬时转染,所有细胞使用方法简单,可携带大片段DNA,通用于各种类型的裸露DNA或RNA,能转染各种类型的细胞,没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率,但在体内,能被血清清除,并在肺组织内累积,诱发强烈的抗炎反应,导致高水平的毒性,这在很大程度上限制了其应用。
阳离子聚合物 :稳定转染,瞬时转染,所有细胞。除了具有阳离子脂质体的转染效率高,操作简单,适用范围广,重复性好等特点外,还具有在体内,转染效率高,细胞毒性低等特点,是新一代的转染试剂。
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