细胞培养知识系列（五）
41、如何检测内毒素(热源)水平？
LAL（LimulusAmebocyteLysate）试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang发现细菌可引起鲎（Limuluspolyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。胎牛血清的内毒素检测是在GrandIsland，按照手册上Gel-clot方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。）
42、可以使用固体形式的MurashigeSkog培养基吗？
如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。
对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。下表列出温度改变10℃时，PH值的变化情况例如20℃下配制PH7.4Tris缓冲液,40℃时PH值为7.4-（2x0.310）＝6.7817.室温下(25℃)配制的
44、Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？
缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mMTris-HC溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。
45、昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少？
生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。
46、HighFive细胞有任何其它名称吗？
HighFive细胞也被称为Trichoplasiani5B1-4和BTI-TN-5B1-4。
47、在HighFive无血清培养基中去污剂的浓度是多少？
HighFive无血清培养基中去污剂的浓度：0.025g/LTween-80，1.0g/LPluronicPoly-all。
48、HighFive细胞用多大的密度冻存？
3.0x10E6cells/ml
49、在果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对细胞有害吗？
可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。
50、如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？
我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：1)去除培养基。2)用2ml1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS.3)加入2ml1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。4)37℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。5)向细胞中加入2ml细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）6)离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。7)用新的培养基重新悬浮细胞。传代。
51.在Sf9,Sf21,和highFive细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？
为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。
52.如何评估ES细胞合格的胎牛血清？
使用D3ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。相关生长效率分析：当ES细胞以非常低的密度传入包含10％胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES细胞克隆的能力。细胞毒分析：当以非常低的密度传入包含30%胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。相关形态学和分化分析：检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。）经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。
53、在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？
通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。
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发布于 ： 2021-07-15
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