有没有高手来指导一下c57乳鼠心肌细胞分离培养。
2017-03-25
问题描述：
这两天实验需要分离乳鼠心肌细胞，操作了两次，但是效果都不好。细胞不贴壁，大量漂浮死亡。我是新手，也没有人指导，只能自己查文献摸索条件，想跟各位老师请教一下，争取早点培养成功。
大概步骤如下：c57小鼠大概六七只，酒精浸泡后不处死取出，迅速打开胸腔取出心脏放入冰PBS冲洗。待心脏取出完毕，冲洗移入有PBS青霉素小瓶中用眼科剪剪成较小组织块。
之后加入0.1％胰酶消化（之前浓度为0.25％，活细胞数量更少。）吹打1min.放入孵箱中3min.弃去上清，加入∥型胶原酶（0.1％）吹打10Min，放入孵箱15Min。取出后加入1ml胰酶。吹打1Min后加入含血清F12培养液终止消化，800转离心5Min。之后取沉淀重悬种板。90Min差速贴壁法纯化心肌细胞。
48h后只有少量（个位数）细胞贴壁，呈三角形。
第一次用0.25％胰酶时离心后有大量鼻涕样物质。
第二次胰酶浓度减小后没有，但细胞沉淀少，且为半透明微白。是不是离心时间不够。
感觉细胞整体状态都不好，几次都没有大量心肌细胞，更不用说观察到心肌细胞搏动。
老师们能不能帮忙分析一下是哪里的原因呢。
有没有比较稳定的小鼠乳鼠心肌细胞分离步骤呢。
希望大神快点出现。
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dxy_g7kz4xfw
用户
展开引用dxy_g7kz4xfw 这两天实验需要分离乳鼠心肌细胞，操作了两次，但是效果都不好。细胞不贴壁，大量漂浮死亡。我是新手，也没有人指导，只能自己查文献摸索条件，想跟各位老师请教一下，争取早点培养成功。大概步骤如下：c57小鼠大概六七只，酒精浸泡后不处死取出，迅速打开胸腔取出心脏放入冰PBS冲洗。待心脏取出完毕，冲洗移入有PBS青霉素小瓶中用眼科剪剪成较小组织块。之后加入0.1％胰酶消化（之前浓度为0.25％，活细胞数量更少。）吹打1min.放入孵箱中3min.弃去上清，加入∥型胶原酶（0.1％）吹打10Min，放入孵箱15Min。取出后加入1ml胰酶。吹打1Min后加入含血清F12培养液终止消化，800转离心5Min。之后取沉淀重悬种板。90Min差速贴壁法纯化心肌细胞。48h后只有少量（个位数）细胞贴壁，呈三角形。第一次用0.25％胰酶时离心后有大量鼻涕样物质。第二次胰酶浓度减小后没有，但细胞沉淀少，且为半透明微白。是不是离心时间不够。感觉细胞整体状态都不好，几次都没有大量心肌细胞，更不用说观察到心肌细胞搏动。老师们能不能帮忙分析一下是哪里的原因呢。有没有比较稳定的小鼠乳鼠心肌细胞分离步骤呢。希望大神快点出现。......没有人来吗
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dxy_y30in3e8
用户dxy_g7kz4xfw没有人来吗
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dxy_g7kz4xfw
用户dxy_y30in3e8楼主现在进行到哪步了？现在已经差不多可以得到出现搏动而且细胞状态的心肌细胞了。但是最近换了新的胶原酶感觉有点不稳定，有时候离心之后得到的是半透明的沉淀而不是之前的白色沉淀。不知道是不是消化过了，您呢。细胞怎么样。
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咕咚叮咚
用户请问楼主每只老鼠能提多少细胞
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晓涵落1121
用户胰酶消化时间太短。
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dxy_y30in3e8
用户楼主现在实验进度如何了？我也需要分离心肌细胞，求讨论
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