| 实验步骤 | 密度梯度离心法试剂配制(1)淋巴细胞分层液：有成品供应，密度为(1.077±0.001)g/ml。 (2)台盼蓝染液：见附录2。 操作方法(1)取血放入抗凝管，摇匀，用pH7.2——7.6的Hank缓冲液(或磷酸盐缓冲液)稀释血液1——2倍。 ⑵取淋巴细胞分层液3——4ml，放入15mmxl50mm的试管中。 (3)用毛细吸管吸取稀释血液，在离分层液面上Icm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，稀释血液与分层液体积比例约为2:1。 (4)用水平离心机以2000r/min离心30min，离心后其中的内容物分为三层，上层为血浆(内含血小板)，中间层为分层液，底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层。 (5)用毛细吸管轻轻插入到白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层的单个核细胞(图1.1)，移入另一试管中。 (6)加5倍以上体积的不含Ca2+、Mg2+的Hank缓冲液，混勻，1500r/min离心lOmin，吸弃上清，重复洗涤2次。 (7)末次离心后，吸尽上清，用含10%血清的培养基重新混悬细胞，取1滴细胞悬液计数。 (8)细胞活力检测：取IxlO6〜2xl06个细胞悬液加i滴2%台盼蓝染液混勻，加盖片，显微镜高倍镜检，活细胞不着色，折光强；死细胞被染成蓝色，体积略膨大。活细胞数应在95%以上。 注意事项（1）用稀释的全血可使单个核细胞获得率升高，将稀释的血液叠加于分层液上时，一定要细心，动作要轻，避免冲散分层液面或与分层液的混合而影响分离结果。 （2）配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗、具缓冲作用并对细胞无毒性。 （3）吸取单个核细胞时，应避免吸出过多上清液或分层液而导致血小板污染 （4）配制好的单个核细胞可放室温或0-4℃，后一条件较好，可减少细胞代谢活动。注意不要迅速改变其所处的温度，以免造成「温度」休克。 备注大容量血液可先用甲基纤维素或羟乙基淀粉沉降后，再采用上述方法分离。 |
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