实验步骤 | 密度梯度离心法试剂配制(1)淋巴细胞分层液:有成品供应,密度为(1.077±0.001)g/ml。 (2)台盼蓝染液:见附录2。 操作方法(1)取血放入抗凝管,摇匀,用pH7.2——7.6的Hank缓冲液(或磷酸盐缓冲液)稀释血液1——2倍。 ⑵取淋巴细胞分层液3——4ml,放入15mmxl50mm的试管中。 (3)用毛细吸管吸取稀释血液,在离分层液面上Icm处,沿试管壁徐徐加入,使稀释血液量叠于分层液上,稀释血液与分层液体积比例约为2:1。 (4)用水平离心机以2000r/min离心30min,离心后其中的内容物分为三层,上层为血浆(内含血小板),中间层为分层液,底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层。 (5)用毛细吸管轻轻插入到白膜层,沿试管壁周缘吸取界面层的单个核细胞(图1.1),移入另一试管中。 (6)加5倍以上体积的不含Ca2+、Mg2+的Hank缓冲液,混勻,1500r/min离心lOmin,吸弃上清,重复洗涤2次。 (7)末次离心后,吸尽上清,用含10%血清的培养基重新混悬细胞,取1滴细胞悬液计数。 (8)细胞活力检测:取IxlO6〜2xl06个细胞悬液加i滴2%台盼蓝染液混勻,加盖片,显微镜高倍镜检,活细胞不着色,折光强;死细胞被染成蓝色,体积略膨大。活细胞数应在95%以上。 注意事项(1)用稀释的全血可使单个核细胞获得率升高,将稀释的血液叠加于分层液上时,一定要细心,动作要轻,避免冲散分层液面或与分层液的混合而影响分离结果。 (2)配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗、具缓冲作用并对细胞无毒性。 (3)吸取单个核细胞时,应避免吸出过多上清液或分层液而导致血小板污染 (4)配制好的单个核细胞可放室温或0-4℃,后一条件较好,可减少细胞代谢活动。注意不要迅速改变其所处的温度,以免造成「温度」休克。 备注大容量血液可先用甲基纤维素或羟乙基淀粉沉降后,再采用上述方法分离。 |
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