SP细胞分选方法

分选原理

Hoechst-SP细胞的分选纯化是干细胞纯化方案中的一部分。一些研究者利用某些单一的细胞表面标记，另一部分研究者则利用一些表面标记的组合及一些细胞特征，如利用SP细胞有低突光染色的特点来研究SP细胞。传统的方法是用单一波长，利用Hoechst染料能在干细胞内富集的特点来进行分选，虽然分选出的具有低G〇期的细胞群中通常都包含有SP细胞，但是不管是对多种细胞群或者是对sp细胞群，这种方法都不能很好地加以鉴别。所以在此我们用的是双波长的方法对SP细胞进行分析和分选。

研究表明在干细胞中只有SP细胞具有干细胞的活性，而且它们与其他的干细胞具有严格同源性，因此SP细胞同样表达干细胞表面的一些标记。SP细胞群表达低H0echst33342荧光，因为它们有与多药耐药(MDR)类似的机制，即主动将染料泵出细胞外。而且有发现表明染料释出量和干细胞活性有直接的相关性。例如，位于SP细胞群最低位置处的细胞(有最强的染料释出的能力，所以结合的染料最少)表达有最强的干细胞活性。而且，SP细胞对染色的条件具有高度的敏感性，因此，对干细胞中sp细胞进行分选纯化的优点在于，它对其他物种或者组织中的干细胞有潜在的应用价值。

实验方法

细胞准备

(1)用温度计检查水浴箱使水温精确保持在37丈。在准备骨髓细胞时，将DMEM+培养基放在水浴箱中预热。对于非骨髓的其他组织，可以用蛋白酶，例如，用胰酶或胶原蛋白酶分解提取细胞，并计数细胞总量，使细胞浓度达到10^6个

(2)尽可能仔细并且准确计数有核细胞的数量，最大可能地排除红细胞的干扰。红细胞呈盘状，比其他细胞小，在显微镜下，它们有时在对应的中间凹陷处出现黑点，以此可以与其他细胞区别。红细胞在骨髓细胞中约占20%，如果不能通过肉眼将它们与有核细胞区分开，可以使用一些溶解红细胞的方法将它们去除。在显微镜下分离完全的骨髓细胞以得到没有细胞团块的单个细胞的悬液。

(3)4℃条件下，以500g的速度将骨髓细胞离心5min，用预热的DMEM+培养基溶液在250ml聚丙烯离心管中重新悬浮细胞并混合均匀，使细胞浓度达到10⁶个/ml。对于大量的骨髓细胞染色，250ml聚丙婦离心管是最方便的，同样5〇ml离心管也可以使用。但
是需要注意的是离心管的材质必须是聚丙烯，因为如果使用聚乙烯离心管，很多细胞会粘附在管壁上。

注意：有时收到人的骨髓标本的时间已经很晚，细胞制备和分选不能在同一天内进行，我们建议骨髄标本在用Hoechst染料染色前必须保存在4¾过夜。这种方法只能在不可予免时使用，不鮮为常规鮮。娜二天早晨，爵_加温至沉，重新悬浮成10⁶/ml浓度的细胞悬液，然后再用Hoechst染料染色。为了证实流式细胞仪分析的细胞正是我们想要的细胞，可以事先保存一部分细胞，在加入Hoechst染料染色之前加入50umol/L的异搏定，以阻断Hoechst在这部分SP细胞中的释出。用这部分sp细胞证实SP细胞门内SP细胞的存在。异搏定或者其他的MDR抑制剂可以减少染料从细胞中释出的速度。

Hoechst33342染色

(1)加入lmg/mlHoechst33342使终浓度达到5ug/ml，轻柔混合均勻。

(2)将细胞在37℃水浴箱中孵育90min(以C57Bl/6小鼠为例)，确保水温保持在37℃，在孵育过程中混勻离心管数次。由于染色对温度很敏感，因此建议使用专用浴箱。

(3)90min后，将细胞以500g离心，用冰浴过的HBSS重新悬浮细胞，如果样本不准备用其他抗体做进一步染色，可以在冰的HBSS中加入2ug/ml的碘化丙锭，以鉴别死细胞。、所有后续的操作必须在4T条件下进行，以防止Hoechst染料从细胞内释出。

注意：碘化丙锭的额外加入其实对于SP细胞分析不是必需的，但是却是有帮助的。因为Hoechst染料有时对骨髓细胞是有毒性的，而峡化丙锭可以排除死细胞的干扰。

(4)这时，样本就可以直接在流式细胞仪上检测或者用其他抗体进行进一步染色以确定特定的SP细胞群。

注意：小鼠85%的SP细胞均表达Sca-1+、c-Kit+、CD45+，而细胞系的标记如CD34表达阴性。我们推荐使用两种抗体进行染色，一种是大部分SP细胞表达阳性的抗体(Sca-I或c-Kit)，另一种是SP细胞不表达而其他大部分骨髓细胞表达阳性的抗体(Gr_i或B22〇)。所以推荐的抗体组合是Sca-I-PE和Gr-1-FITC。人的SP细胞可以用CD34和其他标记来染色。

流式细胞仪的设置

用配有分选功能的BDFACSVantage流式细胞仪分析和分选SP细胞，流式细胞仪必须配备能激发Hoechst33342染料的紫外UV激光及相应的滤光片，以区分和接受染料发射的焚光。碘化丙锭在紫外条件下也能被激发，但是碘化丙锭染色是出现很亮的红光，而Hoechst33342发出的是蓝光，因此很好区别。

流式细胞仪上机分析

(1)将经过Hoechst染色的细胞放置在流式细胞仪的上样位置，如有可能，用冷却装置使其保持低温。没有必要在FSC/SSC参数的图中设门，而是用Hoechst红光(x轴）和Hoechst蓝光(y轴)作图，将参数设为线性，通过调节电压使红细胞位于左下角，死细胞(碘化丙锭染色时非常明亮的细胞)排列成水平的线状一直延伸到右侧，剩下的细胞位于中间。同时有必要通过去除右上角的细胞群将主要的Gg、胞群与S-G2M细胞区别开。

(2)去除红细胞和死细胞，在已有的图中做活细胞门，然后收集活细胞门内50〇〇〇〜100000个细胞以更明确地确定SP细胞区域。

(3)—旦通过抗体染色和(或)用前面提到的添加异搏定的方法确定了SP细胞的准确位置后，细胞就可以用标准的方法进行分选了，分选完的细胞收集在无菌的离心管中，可以进行后续的培养和转移。