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Preparation of cell lysates from yeast by enzymatic digestion of the cell wall
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PreparationofcelllysatesfromyeastbyenzymaticdigestionofthecellwallMaterialsChemicals

Lyticase[orZymolase100T(ICN,USA)]
Brij58
Workingbuffer
50mMTris-HClpH8.0

10%sorbitol

Stocksolutions

100mMPMSF(phenylmethylsulfonylfluoride)inisopropanol
1mg/mlleupeptininwater
1mg/mlpepstatinAinmethanol
100mMspermidine(pH7.8)
100mMEDTA
1MMgCl2.
4MKCl
Procedure
1.ResUSPendthecellsinanequalamountofchilledworkingbuffer.AdjustthepHofthesuspensionto8.2withsolidTrisbase.
2.Freezethesuspensionrapidlyinliquidnitrogeninanultracentrifugetube.(Freezingandthawingisessentialinthisprocedure).
3.Thawthefrozensuspensionisthawedrapidlyandplaceitonice.
  • Add10µlPMSF(100mM)permlofcelsuspensionatthispoint.
4.Addthefollowingsolutionstothecellsuspension:4MKCltoaconcentrationof1M,100mMspermidineto5mM,andlyticaseto2000U/ml.
  • Insteadoflyticase,Zymolase100Tcouldbeusedatafinalconcentrationof0.5mg/ml.
5.Mixgentlyandincubatethesuspensionfor30minonice,withoccasionalswirling.Usuallyover90%ofthecellsareconvertedtospheroplasts.
6.Adddifferentproteaseinhibitors:2µl/mlEDTA(0.5M),1µl/mlPMSF(100mM),1µl/mlleupeptin(1mg/ml),and1µl/mlpepstatinA(1mg/ml)tothesuspension.
7.AddBrij58toaconcentrationof0.1%andheatshockthespheroplastsfor3minat37°C.
8.Removecelldebrisbycentrifugationat4°Cfor30minat45000rpmusinga45Tirotor(Beckman).

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