支原体之检测：

直接培养法

原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。

特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。

缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来(例如M.hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。

材枓：dextrose、L-arginineHCl、DifcoPPLObroth(Difco0554-17-1)horseserum、15%yeastextractsolution(autoclaved)、Bactoagar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70%ethanol擦拭内壁。）

培养基制备：

基本配方为DifcoPPLObroth(60%),马血清(20%),15%yeastextreatsolution(10%),10xstocksolution(10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10xstocksolution或加入thalliumacetate(1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。

·10xstocksolution(1liter)：称取50gdextrose，10gL-arginineHCl，溶于1liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100ml至瓶中，保存于-70℃。

·液体培养基(1liter)：称取21g之DifcoPPLObroth，0.02gphenolred于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15%yeastextractsolution，及100ml解涷之10xstocksolution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。

·固体培养基(1liter)：称取21g之DifcoPPLObroth，0.02gphenolred，15gBactoagar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15%yeastextractsolution及100ml解冻之10xstocksolution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。

步骤：

·取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1ml液体培养液涂在agarplate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。

·另取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agarplate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。

·另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasmalaidlawii(ATCC23206)与M.arginini(ATCC23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。

结果判读：

·支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agarplate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。

·典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried-egglike)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。

·若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agarplate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agarplate，若是细胞则不会生长。