酵母DNA分离

1）酵母DNA微量制备（40ml）

1．在125ml三角瓶中用40mlYPD培养液在30℃条件下培养细胞达最大生长量（过夜）。

2．将上述培养物移入螺盖离心管，用医用离心机或SorvallSS－34转头以5000r/min离心5分钟，弃去上清液。

3．将细胞悬浮在3ml的0.9mol/L山梨醇－0.1mol/LNa₂EDTA(pH7.5)溶液中。

4．加0.1ml的2.5mg/ml消解酶100T，置37℃条件保温1小时。

5．用医用离心机或SorvallSS－34转头以5000r/min离心5分钟，弃去上清液。

6．将细胞重新悬浮在5ml的50mmol/LTris-HCl(pH7.4)-20mmol/L醋酸钠溶液中。

7．加0.5ml的10％十二烷基硫酸钠（SDS），混匀。

8．置65℃保温30分钟。

9．加1.5ml的5mol/L醋酸钾溶液，在冰浴上放置1小时。

10．用SorvallSS－34转头以1000r/min离心10分钟。

11．将上清液转移至干净的塑料离心管中，室温下加入两倍体积的95％乙醇，混匀，以5000～6000r/min离心15分钟。

12．弃上清液，将沉淀物干燥，然后悬浮在3mlTE缓冲液（pH7.4）中，此操作可能需要几个小时。

13．用SorvallSS－34转头以1000r/min离心15分钟，将上清液转移到一个新试管，弃沉淀物。

14．加入150μl的1mg/mlRNaseA溶液，在37℃下保温30分钟。

15．加入一倍体积的100％异丙醇，轻轻混匀，取出呈松散纤维状的沉淀物，无需离心，让其自然干燥。

16．将沉淀物悬浮在0.5mlTE缓冲液（pH7.4）中，置4℃保存。酵母DNA的最终浓度约为200μg/ml。如果最后的溶液混浊不清，用异丙醇再次沉淀DNA或用SorvallSS－34转头以1000r/min离心15分钟。

2）酵母DNA微量制备（5ml）

1．按酵母于5mlYPD中，置30℃培养过夜。

2．用医用离心机以2000r/min离心5分钟沉淀细胞，弃上清液。

3．将细胞悬浮在0.5ml的1mol/L山梨醇－0.1mol/LNa₂EDTA(pH7.5)缓冲液中，转动一支1.5ml离心管中。

4．加入0.02ml的2.5mg/ml的消解酶100T溶液，置37℃保温1小时。

5．离心1小时。

6．弃上清液，把细胞悬浮在0.5ml的50mmol/LTris-HCl(pH7.4)-20mmol/LNa₂EDTA溶液。

7．加0.05ml的10％SDS，混匀。

8．置65℃保温混合物30分钟。

9．加0.2ml的5mol/L醋酸钾，把离心管在冰浴中放置1小时。

10．离心5分钟。

11．将上清液转移到一洁净微型离心管，室温下加入等体积的无水异丙醇，混匀，放置5分钟。短暂离心（10秒钟）弃上清液，让沉淀自然干燥。

12．用0.3mlTE缓冲液（pH7.4）重新悬浮沉淀。

13．加入15μl的1mg/ml的RNaseA溶液，置37℃保温30分钟。

14．加0.03ml的3mol/L醋酸钠，混匀，用0.2ml的无水异丙醇沉淀，再短暂离心收集DNA。

15．弃上清液，自然干燥，用0.1～0.3mlTE缓冲液（pH7.4）重新悬浮DNA。

16．在使用限制性内切酶酶解DNA之前，有必要将最终浓度溶液离心较长时间（15分钟）以便除去可能抑制酶解的不溶性物质。

3）10分钟制备酵母DNA方法

大肠杆菌或酵母转化质粒的制备

1．在质粒DNA选择性培养基中，置30℃培养少量培养物过夜。

2．将培养物转入一支1.5ml的微型离心管，离心5秒，收集细胞。

3．小心倾去上清液，轻弹离心管，使沉淀重新悬浮于残余培养液中。

4．加入0.2ml的2％TritonX－100，1％SDS，100mmol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl(pH8)，1mmol/LNa₂EDTA；加入0.2ml的苯酚：氯仿：已戊醇（25：24：1）；加入0.3g酸洗过的玻珠。

5．振荡2分钟。

6．离心5分钟。

7．用1～5μl含DNA的水相转化0.2ml的大肠杆菌受体菌，用15μl水相转化酵母菌。

用于Southern分析的基因组DNA分离

1．用YPD培养基，置30℃培养10ml酵母至最大生长量。

2．用医用离心机离心2分钟，弃上清液，收集细胞，用0.5ml蒸馏水重新悬浮，将细胞转入1.5ml微型离心管中，离心5秒收集细胞。

3．重复第二步。

4．重复第二步。

5．加0.2mlTE缓冲液（pH8），振荡3～4分钟。

6．离心5分钟，将水相移至洁净试管，加1ml的无水乙醇，上下倒置，混合均匀。

7．离心2分钟，弃上清液，悬浮在0.4mlTE缓冲液和3μl的10mg/ml的RNaseA溶液，置37℃保温5分钟，加入10μl4mol/L醋酸铵和1ml的无水乙醇，上下倒置，混匀。

8．离心2分钟，弃上清液，自然干燥后，用50μl的TE缓冲液悬浮，每份样品用10μl进行Southern印迹分析，每份用量约2～4μgDNA。

4）酵母基因组DNA：玻珠制备法

1．用5ml培养基在30℃下，摇床培养过夜。

2．转移培养物至13mm×100mm的玻璃离心管中，用台式离心机以1500r/min离心5分钟，收集细胞。

3．用3ml无菌水洗细胞，同上离心。

4．用500μl裂解缓冲液再次悬浮。

5．加入干净玻珠（约1.5mlEppendorf离心管的2/3体积）和25μl的5mol/LNaCl。

6．以最高速振荡1分钟。

7．用2000r/min离心2分钟。

8．用P-1000移液器转移上清液至一支1.5ml的离心管。

9．加入500μl苯酚，振荡，离心1分钟。用P-1000移液器吸取水相，转移至洁净离心管，加入500μlSEVAG（氯仿：已戊醇，24：1），同上振荡，离心，抽提。

10．加入1ml的95％的冷冻乙醇，在-20℃下沉淀1小时。

11．以最高转速离心沉淀DNA，弃上清液，用70％乙醇清洗，最后悬浮在250μlTE缓冲液中。

12．加25μl的EDTA-Sark和5μl的蛋白酶K（10mg/ml），置37℃保温30分钟。

13．加250μl的5mol/L醋酸铵，重复9、10步骤。

14．收集DNA，用70％乙醇洗，悬浮于100μl的TE缓冲液。