酵母的高效转化
酵母的高效转化 1．接种5ml液体YPAD或10mlSC，30℃下振荡培养过夜。 2．计数过夜培养物细胞密度，以最终5×106个/ml的细胞密度接种50mlYPAD培养液。 3．置30℃，200r/min振荡培养至2×107个细胞/ml，通常需要3～5小时，该培养物的细胞足够供十次转化用。 4．用50ml无菌离心管以3000g（2500r/min）离心5分钟，收获细胞。 5．弃培养液，把细胞悬浮在25ml无菌水中，再同上离心。 6．弃水，把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中，转悬浮物到一个无菌1.5ml离心管。 8．悬浮细胞到最终500μl体积其中大约含400μl的100mmol/L醋酸锂。 9．将1ml单链载体DNA样品煮沸5分钟，快速在冰水中冷却。 10．振荡细胞悬浮液，取50μl样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，用微量取样器除去醋酸锂。 11．基本“转化混合液”由下列成分组成，小心按下列顺序如下： 240μlPEG（50%w/v） 36μl1.0mol/L醋酸锂 25μl单链载体DNA（2.0mg/ml） 50μl水和质粒DNA（0.1～10μg） 12．剧烈振荡每个反应管每个反应管直到细胞完全混匀，通常需要1分钟左右。 13．置30℃保温30分钟。 14．置42℃水浴中热激20～25分钟。 15．以6000～8000r/min离心15秒，用微量移液器除去转化混合液。 16．吸0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。 17．用等份的200μl转化混合液涂选择平板。
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发布于 ： 2018-12-26
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