TUNEL细胞凋亡检测程序
一、原理与意义：
TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的链霉亲和素streptavidin特异性结合，后者又与POD底物H2O2、二氨基联苯胺（DAB）产生深棕色反应，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂
1、器材：光学显微镜及其成像系统、摇床、组化笔、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的移液器及枪头等。
2、试剂：试剂盒含TdT2×、Biotinylated标记的dUTP、标记streptavidin的HRP、SSC20×、Proteinasek、DAB20×、DAB底物Buffer20×、H2O220×；
3、自备试剂：
（1）1×PBS（pH7.4，2.5L=20.0157g137mMNaCl+0.499552g2.68mMKCl+0.50013075g1.47mMKH2PO4+7.253337g8.1mMNa2HPO4），115℃×15min；
（2）0.85%NaCl500ml=4.25gNacl+500ml三蒸水，115℃×15min；
（3）4%多聚甲醛500ml=20g多聚甲醛+500mlPBS在65℃水箱中3h多，再放入4℃保存。
（4）DNaseIbuffer：40mMTris-HCl（pH7.9）+10mMNaCl+6mMMgCl2+10mMCaCl2；
（5）ProteinaseKbuffer：100mMTris-HCl（pH8.0）+50mMEDTA；
（6）DNase1（原液1000U/ml按1：99DNase1缓冲液稀释至10U/ml）；
（7）DAB工作液（临用前配制，5ul20×DAB+1ul30%H2O2+94ulPBS）
（8）20μg/mlProteinaseK工作液（按1：500稀释贮存液1mg/ml）。
（9）另外，双蒸水、无菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、苏木素。
三、实验步骤
1、脱蜡：用二甲苯浸洗5min×2次；
2、水化：用梯度乙醇（100%×5min、100%×3min、95%×3min、85%×3min、70%×3min、50%×3min）；
3、浸洗：0.85%NaCl×5min⇒PBS洗5min；
4、固定：浸入4%多聚甲醛15min；
5、浸洗：PBS5min×2次；
6、细胞通透：用每片100ul20μg/mlProteinaseK处理组织15（10~30）minRT；
7、浸洗：PBS洗5min；
8、固定：浸入4%多聚甲醛5min；
9、浸洗：PBS5min×2次；
10、平衡：加100ul平衡液，湿盒平衡10（5~10）min；
11、制备TUNEL反应混合液：处理组用1ulrTdT+1ul生物素标记的dUTP+98ul平衡液混匀；而阴性对照组不加rTdT，改为三蒸水；阳性对照组先加入100ulDNase1缓冲液孵育5min，甩掉液体后再加100ulDNase1（10U/ml）酶切10min，用去离子水冲洗4次，PBS浸洗5min，后面步骤从第10步开始。
12、标记反应：加100ulTUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
13、终止反应：浸入2×SSC15min；
14、浸洗：PBS5min×3次；
15、封闭POD：浸入0.3%H2O215min；
16、浸洗：PBS5min×3次；
17、酶标反应：加100ulstreptavidin标记HRP（按1：500PBS稀释）30min；
18、浸洗：PBS5min×3次；
19、DAB显色（避光）：加100ulDAB混合液（50ulDAB+50ulDAB底物缓冲液+50ulH2O220×+950ul三蒸水）10min左右，镜下出现浅棕色背景时。
20、用去离子水冲洗几次；
21、用苏木素复染，3s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水（50、70、85、95、100、100%各1min）、二甲苯透明1min×2次、中性树胶封片。
22、加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）。
四、注意事项
1、结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
2、初次检测细胞凋亡，zui好设置阳性对照片。
3、血细胞含量高的组织，尽可能延长过氧化氢的灭活时间。
4、苏木素的复染时间需要摸索。
5、每片所加试剂可调整，一般30~100ul不等，但也要防止液体挥发而干片，且反应均在放置湿盒内。