Description
Cultrex®BasementMembraneExtract(BME)isasolubleformofbasementmembranepurifiedfromEngelbreth-Holm-Swarm(EHS)tumor.Thisextractprovidesanaturalextracellularmatrixhydrogelthatpolymerizesat37°Ctoformareconstitutedbasementmembrane.Basementmembranesarecontinuoussheetsofspecializedextracellularmatrixthatformaninterfacebetweenendothelial,epithelial,muscle,orneuronalcellsandtheiradjacentstromaandthatplayanessentialroleintissueorganizationbyinfluencingcelladhesion,migration,proliferation,anddifferentiation.ThemajorcomponentsofBMEincludelaminin,collagenIV,entactin,andheparansulfateproteoglycans.
Cultrex®StemCellQualifiedRGFBMEisaBasementMembraneMatrixthathasbeendeveloped,producedandqualifiedspecificallyforattachmentandmaintenance ofembryonicandinducIBLepluripotentstemcells. Cultrex®StemCellQualifiedRGFBMEisprocessedtoreducematrix-associatedgrowthfactorsandprovideamoredefinedmodelsystem.
Qualitycontrolspecifications:
- Mousecoloniesareroutinelyscreenedforpathogensusing mouseantibodyproduction(MAP)testing.
- Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)tumorisLDEV-free.
- PathClear®–testednegativebyPCRfor17bacterialandvirusstrainstypicallyincludedinmouseantibodyproduction(MAP)testing,plus13additionalmurineinfectiousagentsincludingLDEV,foratotalof31organismsandviruses.
- Nobacterialorfungalgrowthdetectedafterincubationat37°Cfor14daysfollowingUSPsterilitytestingguidelines.
- Endotoxinconcentration≤8EU/mlbyLimulusAmoebocyteLysate(LAL)assay.
- Proteinconcentrationof12–18mg/ml.
- NomycoplasmacontaminationdetectedbyPCR.
- ProvidedinDulbecco’sModifiedEagle’smedium(DMEM)withoutphenolred,with10µg/mlgentamicinsulfate.
- GelstABIlitytestedforaperiodof14daysat37°C.
- BIOLOGicalactivitydeterminedforeachlot:
- PromotestheattachmentofhumaniPSCs.
- EffectivelymaintainshumaniPSCsinapluripotentstateinafeeder-freeculture.
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原核生物比如大肠杆菌促进增殖药物还不如提供更好的营养条件、足够的环境;抑制类药物如上。
根据细胞种类不同,可能需要不同成分的培养液,来达到促进/抑制的作用
首先,可以让学生设想细胞数目增加需要那些方面准备?过程会怎么样?这实际上是学生主体性的体现,有利于学生总体把握细胞增殖的变化规律。
然后,要让学生明白细胞内有好多变化,但我们的学习集中在染色体的变化规律来教学,重点一定要突出染色体这样的变化是为了遗传性状的稳定。复制、螺旋化、移到赤道面、着丝粒分裂、纺锤丝牵拉都是为了染色体结构和数目的稳定,这种动态变化完全可以设想出来,不需要去死记硬背。
最后,由于概念繁杂,一定要对概念进行辨析:染色体和染色质;纺锤体和纺锤丝;赤道面和细胞板。
细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。检测
1.MTT。
MTT法检测原理:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan),而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT法检测细胞增殖算是比较常用的方法了,价格便宜,不过其甲瓒产物不溶于水,需有机溶剂溶解后方可检测,其增加了工作量,同时对结果的准确性产生影响,重复性较差吧。
2.CCK8
CCK8检测原理:CCK8中的主要成分WST®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜,生成甲臜的量与细胞数成正比,可间接测定活细胞数量。
相比较于MTT而言,CCK8的灵敏度要更高,其生成的甲瓒产物溶于水,重复性和准确性上要优于MTT法,对于细胞的毒性较小,不过价格也是相比MTT要贵一截。
3.通过标记DNA检测细胞增殖的常用的大概是Brdu和EDU用的比较多。
Brdu是一种胸腺嘧啶核甘类似物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)参入正在复制的DNA中,之后我们通过抗Brdu的抗体与荧光二抗快速检测细胞的DNA复制活性。EDU也是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中,基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性,类似于一种化学反应吧,而无需抗原抗体结合。
相比较而言,Brdu或者edu更适合用于siRNA、miRNA、小分子化合物及其药物筛选等。同时Brdu或者EDU也适用于小鼠,大鼠及其他动物模型的各种组织器官(血管除外)的细胞增殖检测。关于Brdu和EDU的各自优缺点可以参考下帖。具体问题具体分析吧,目前来看EDU检测越来越普遍吧。关于Brdu检测细胞增殖,一种可以使用免疫荧光通过Brdu-FITC与DAPI双染判断细胞的增殖情况。
一般对于细胞来说都是免疫荧光的常规步骤吧,只是需要一步盐酸进行变性DNA和中和。
1.细胞铺板24孔板或者6孔板。可以进行加药处理细胞
2.加入一定终溶度的BrdU继续培养一定的时间。随后弃去孔内溶液,PBS润洗3次。
3.4%多聚甲醛固定细胞30min,PBS再润洗3次
4.0.1%TritonX-100处理细胞15min后,接着PBS润洗3次
4。接着2MHCl处理30min,再加入0.1M的硼酸中和10min,PBS润洗3次。
5.滴加5%BSA室温封闭30min,弃去液体,滴加1:200稀释的BrdU一抗,4℃孵育过夜。
6.次日,弃去一抗,PBS润洗5次,在避光条件下,滴加1:50稀释FITC标记二抗,室温孵育1h后,PBS再润洗5次。
7.pbs洗5遍,滴加DAPI溶液,室温孵育5到10分钟,PBS洗5遍。
8.荧光显微镜观察。拍照。只是需要注意的是细胞固定这一块吧,如果细胞固定不好的话,细胞容易连在一起而无法分清S期和M期等。同时容易造成细胞碎片吧。
附张失败的图片。
文献中完美的图片:
图片来源:EthanolinducescytostasisofcorticalbasalProgenitors
4.关于EDU,目前一般都是拿试剂盒做的,操作简单方便。步骤相比Brdu而言,少了DNA变性,无需抗体孵育等环节。
细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。
解析:细胞增殖是重要的细胞生命特征。
B、癌胚抗原为肠癌组织产生的一种糖蛋白,故可用于癌细胞的检测,B错误;
下、癌细胞表面糖蛋白减少,故可用于检测细胞癌变的证据,下错误;
D、癌细胞的磷脂分子未发生变化,故不能用于检测细胞癌变的证据,D正确.
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物的过程,藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
比如用CD3、CD28刺激,除了这个还有什么方法吗?增殖!
and还想问问用CD3、CD28刺激是不是所有T细胞都能增殖?
Ki67,在很多肿瘤病理中做,它是判断肿瘤细胞增殖情况的一个指标,越高表示正在肿瘤细胞增殖多,恶性程度越高。P16,是一个抑癌基因,直接作用于细胞周期、抑制细胞分裂的基因,细胞内P16蛋白减少,会引起细胞周期调节紊乱,使细胞无限制增生,甚至癌变。
ki67是什么 Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原,其功能与有丝分裂密切相关,在细胞增殖中是不可缺少 ,但其确切机制尚不清楚. Ki67标记的是处于增殖周期中的细胞。该标记阳性率越高,肿瘤生长越快,组织分化越差,对化疗也越敏感。一般来说,预后较差。
非整倍体无限细胞系和癌细胞株中,仍然存在不同细胞亚群,它们的功能和生长特点有些差异,其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力,细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞,细胞遗传性状、生物学特性相似,利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系,细胞集落率很低。细胞集落化培养之前,应先测定细胞集落形成率,以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
目前认为仅有肿瘤干细胞具有形成集落的能力,集落抑制率常用于抗癌药物敏感试验、肿瘤放射生物学试验。
集落抑制率=(1-(实验组集落形成率/对照组集落形成率))×100%
(一)原理
细胞集落形成率 单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞,大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
(二)实验用品
1.材料:Hela细胞。
2.器材:(直径 60mm )培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂:Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
(三)方法
1.平板克隆形成试验
本法适用于贴壁生长的细胞,包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞,采用常规消化传代方法,制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打,使细胞充分分散,单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数,并用培养基调节细胞浓度,待用。
(3)根据细胞增殖能力,将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿(直径 60mm )中,以十字方向轻轻晃动培养皿,使细胞分散均匀。
(4)培养皿置 37℃ 、5%CO2中培养2~3周,中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时,终止培养,弃去培养液,PBS液小心浸洗2次,空气干燥。甲醇固定15分钟,弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟,流水缓慢洗去染液,空气干燥。
2.软琼脂集落形成试验
本法适用于非锚着依赖性生长的细胞,如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。利用琼脂液无粘着性又可凝固的特性,将肿瘤细胞混入琼脂液中,琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置,琼脂中肿瘤细胞可能向周围作全方位的移动,因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖,从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。造血系统软琼脂集落形成试验方法相同,主要用于有关细胞分化的研究,但使用培养基不同。
在课题组例会上做汇报时,有老师对我用CCK-8做细胞增殖实验提出质疑,他说CCK-8是测细胞活力的
想听听大家的意见,不胜感激
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