实验步骤 | 肽与PNA的接合(接合产物传送人细胞)材料试剂 方法 通过二硫键连接肽和PNA 1.称量0.5〜2mg肽和ImolPNA分别装入不同的离心管中。 2•用2〇0ul去氧DMSO溶解PNA。如果不能溶解,55°C温浴5min,如果还没有溶解,可使用该悬浮液继续实验。 3•在IOOm10.Olm〇l/L乙酸缓冲液中溶解肽(pH5.5)。 4.在每个溶液中都加入200ulDMF(推荐)或DMSO。 5•混合两个溶液并充分振荡。如果PNA仍然没有溶解,1oooog(桌面离心机的最大速度)离心2min,吸取5〜3〇ulTFA加入(取决于沉淀大小),20s后振荡重悬。如果没有TFA可以用6mol/L盐酸胍或7mol/L尿素替代。 另外,还可以将两个赖氨酸连接到羧基端和氨基端来提高PNA溶解度。这样二硫键形成可以在0.01mol/L乙酸缓冲液和乙腈溶液(50/50)中进行。 6•室温振荡或搅拌2h或过夜。避免直接见光。 7•半制备反相-HPLC分离反应产物。 a.梯度取决于肽的疏水性。对于疏水蛋白,使用等度20%洗液B5min,然后使用梯度增加到100%的洗液B40min; 富含精氨酸和赖氨酸的肽的HPLC曲线类似于PNA寡聚体,使得有效的分离很难。可以尝试从0%洗液B60min增加到80%B。 b•检测波长为218nm,肽带的最大吸收值为260nm,指示PNA核酸碱基。使用260nm进行单一波长检测。 8•收集吸收两个波长的色谱峰 9.冻干样品储存于一2〇°C暗处,避免反复冻融。应用质谱仪分析接合物确定正确的产物。 将CPP-S^S^PNA接合物传送到细胞中进行反义应用 10.至少在实验前一天,接种表达目的蛋白的细胞系,使得实验当天细胞汇合度达到40%〜60%。需要6个孔(两个平行反义实验,两个用于控制PNA,两个对照不进行操作)。 12.制备新鲜的〇.lmm〇l/LCPP-SS^NA接合物或解冻一块以前制备的接合物(一20°C保存)。 制备从O.lmmol/L到5umol/L的一系列稀释液,估算低浓度下的反义效应。这需要比本实验中列出的更多的细胞和接合物。 13.55°C加热CPP-S^PNA溶液lmin。 14.在细胞培养孔中,每Iml培养基加入10ul0.1mm〇l/L的CPP-S——S——PNA溶液,CPP-S^PNA最终浓度为lumol/L。 15.37°C培养3h,然后换到完全培养基中。 16.37°C培养至少靶标蛋白质半衰期的2倍时长。 17.收集细胞,用适当方法测定蛋白质的量。 |
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