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方案23.21 黑素细胞的培养
来自 : 蚂蚁淘
实验方法原理胰蛋白酶消化后,用EDTA分散从皮肤片分离的表皮片,然后用添加bFGF(FGF-2)的无血清培养液培养。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
原代培养

第1天

1.用70%乙醇浸洗皮肤标本,然后用D-PBSA浸洗2次。

2.将组织移入无菌100mm培养皿,表皮面朝下。

3.用解剖剪除去皮下脂肪和深部真皮。

4.将剩余的组织用手术刀切成2mm×2mm小块。刀片在组织上摇动,但不要采用锯切。

5.将组织块移入盛有冷的0.25%胰蛋内酶的15ml离心管。

6.在室温条件下,将组织块孵育60~90min。对于某些供体的皮肤,先在4°C条件下孵育18~24h,然后在37°C条件下孵育1~2h,这样可获得较多的黑素细胞。

第2天

7.轻拍离心管,使沉于底部的组织块移动。然后,将离心管内的内容物快速倒入60mm培养皿。

8.用手术镊将组织块逐一地移入100mm干培养皿,上皮面朝下。轻轻摇动组织块,使其接触培养皿底壁。应使表皮层附着在培养皿上,以便用手术镊彻底分离真皮。除去真皮片。

9.将表皮片移入盛有5ml0.02%EDTA(0.7mmol/L)的15ml离心管。注意将表皮片放入EDTA液,不要贴在离心管壁上。

10.轻轻摇晃离心管,使表皮片分散成单细胞。

11.离心(350g,5min),然后吸去上清液。

12.用MHSM混悬细胞。

13.用血细胞计数板计数细胞,然后在35mm培养皿用2ml含有5%FBS的MHSM孵育细胞,细胞密度为1×106个(约2×104~4×104个黑素细胞)。FBS促进细胞贴壁。

14.用含有生长因子和牛垂体提取物的MHSM换液,每周2次。

第3~30天

15.培养24h后,培养的细胞中含有原代角质形成细胞和散在的黑素细胞。角质形成细胞在几天后停止增殖,角质形成细胞克隆在第2周浮起。第2周末,只剩有黑素细胞。在大多数情况下,细胞在2~4周内生长接近汇合,此时准备传代。



传代培养

16.用0.02%EDTA(0.7mmol/L)轻轻浸洗细胞2次。

17.加入3ml0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA(2.5mmol/L)混合液,在37°C条件下孵育。每5min在相差显微镜下观察1次,检査细胞的去附着情况。

18.当大多数细胞去附着时,用10μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂或1ml含有小牛血清的培养液使胰蛋白酶失活。传代时,“血淸刺激”有益于在无血清条件下维持黑索细胞生长。

19.吹打培养皿中的细胞,保证全部黑素细胞去附着。

20.吸出细胞悬液,离心(350g,5min)。

21.吸去上淸液,用含有5%FBS的无钙黑索细胞培养液混悬细胞。每个100mm培养皿内放入2×104~4×104个细胞。黑素细胞很好地贴于塑料培养皿(>75%)要FBS。但是,如果培养皿涂有纤连蛋白或Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白混合物,可不用FBS[ Gilchresteal.,1985]。

22.用无血清或含有血淸的黑素细胞培养液换液,每周2次。用含有血清的培养液培养能获得较多的细胞,但含有血淸的培养液促进成纤维细胞的生长。将Ca2+浓度降至0.03mmd/L不影响黑素细胞的增殖,但抑制成纤维细胞的过度生长[Naeyaertetal.,1991]。

添加激素的黑素细胞培养液(melanocytehormone-supplementedmedium,MHSM):

(a)199培养液(400-1200,Gibco):93.1ml;

(b)EGF(B-DBiosciences):0.1ml,储存浓度为10μg/ml,最终浓度为10ng/ml;

(c)转铁蛋白(Sigma):0.1ml,储存浓度为10mg/ml,最终浓度为10μg/ml;

(d)胰岛素(Sigma):0.1ml,储存浓度为10mg/ml,最终浓度为10μg/ml;

(e)三碘甲状腺原氨酸(Sigma):0.1ml,储存浓度为1μmol/L,最终浓度为1nmol/L;

(f)氧化可的松(Calbiochem):0.5ml,储存浓度为0.28mmol/L,最终浓度为1.4μmol/L;

(g)霍乱毒素(Calbiochem):1.0ml,储存浓度为1μmol/L,最终浓度为1nmol/L。可用牛垂体提取物和双丁酸环腺背酸代替霍乱毒素。牛垂体提取物(Clcmetics)的储存浓度为35μg/ml,最终浓度为0.7ng/ml。双丁酸环腺汗酸(Sigma)的储存浓度为1mmol/L,最终浓度为100μmol/L;

(h)bFGF(Amgen):5.0ml,储存浓度为200ng/ml,最终浓度为10ng/ml。
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