免疫酶标技术 1)直接法 1.标本固定。 2.PBS洗涤2×3分钟。 3.1%H2O2(或1%H2O2甲醇)抑制内源性过氧化物,室温10~20分钟。 4.正常血清(1:10)孵育,室温20分钟。 5.滴加酶标记的抗体37℃1小时或4℃过夜。 6.PBS洗涤3×3分钟。 7.DAB+H2O2显色5~10分钟,镜下控制染色结果。DAB+H2O2应用前15分钟配制。 8.充分水洗后,复染、脱水、透明、封片、镜检。 2)间接法 1.标本固定。 2.PBS洗涤2×3分钟。 3.1%H2O2(或1%H2O2甲醇)抑制内源性过氧化物,室温10~20分钟。 4.正常血清(1:10)孵育,室温20分钟。 5.滴加第一抗体,37℃1小时或4℃过夜。 6.PBS洗涤3×3分钟。 7.滴加酶标二抗,室温1小时。 8.PBS洗涤3×3分钟。 9.0.04%DAB+0.03%H2O2显色5~10分钟。 10.充分水洗后,复染、脱水、透明、封片、镜检。 3)PAP法(过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法) 1.标定固定后,PBS洗涤。 2.1%H2O2(或1%H2O2甲醇)阻断内源性过氧化物,室温10~20分钟。 3.PBS洗涤2×3分钟。 4.正常血清(二抗的正常血清)孵育,室温20分钟。 5.滴加一抗,室温1小时或4℃过夜。 6.PBS洗涤3×3分钟。 7.滴加二抗,室温30分钟。 8.PBS洗涤3×3分钟。 9.加PAP复合物,室温60分钟。 10.PBS洗涤3×3分钟。 11.0.04%DAB+0.03%H2O2显色5~10分钟。 12.充分水洗。 13.苏木精复染,封片观察。 4)双PAP法 1~10同单PAP法。 11.二次加酶标二抗。 12.PBS洗。 13.二次加PAP。 14.PBS洗。 15.0.04%DAB+0.03%H2O2显色5~10分钟。 16.苏木精复染核,封片,镜检。 5)ABC法(卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法) 1~8同PAP法 9)加ABC液,室温60分钟。 10)PBS洗。 11)0.04%DAB+0.03%H2O2显色5~10分钟。 12)充分水洗。 13)苏木精复染核,封片,镜检。