【求助】菌体破碎

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【求助】菌体破碎

2009-02-15

问题描述：

我做大肠杆菌原核表达，选用pGEX系列载体，收集菌体超生破碎后离心取菌体上清，上清内有大量核酸，用GST亲和层析柱纯化蛋白，谷胱甘肽洗脱峰特别小。
问：1如才能提高柱子吸附蛋白量？
2样品中的核酸对吸附有无太大影响？
3我拟采用阴离子交换树脂，问pH8.0条件下除去核酸可否？
4怎么提高样品的澄清度？

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wlnju

用户

GST蛋白纯化得率低，我觉得一般问题不会出现核酸什么的上。就我做过的纯化，我觉得有几个注意点：一是蛋白本身，最好不是包含体形式表达，要不然上清中本来蛋白就少。二是结合有两种方式，一是过柱子，二是将微珠和上清在4度混匀一小时，再自填装，效果要好很多很多，吸附更好。三是谷胱甘肽洗脱时，ph特别重要，需要在ph8.0时，谷胱甘肽活性才最好，最后一步最容易忽略，我建议你检查是否谷胱甘肽将蛋白完全洗脱下来了。

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huolizwh

用户

这个问题我考虑过，但是请问如何检测蛋白是否完全洗脱下来哪？

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wlnju

用户

最后如果是用NaOH清洗柱子，可以看看清洗液里有没有如果是自装柱，可以吸点点微珠加loADIng煮沸，跑page考染了再看

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huolizwh

用户

谢谢!