作为在实验室奋斗的「奋青」们,都知道RealtimePCR(RT-PCR)是并列于westernblot的基础实验之一。不会做PCR的人都不好意思说自己在搞科研,呵呵哒。作为一门核心技术,也是相对来说出结果快速的技术,本次小笔将一改逗比风格,高冷正经脸来分享该技能,各位接好了啊。
RT-PCR原理的话简单来说,就是采用荧光基团标记的特异性探针来跟踪PCR产物,做到全程监控,后期结合电脑软件分析定量得出待测样品的初始量。步骤如下:
RNA提取和测定
1.平衡:-80℃取出TRIZOL裂解的细胞(也可以当时裂解;如果是组织,需要超声破碎后再进行后续步骤),置于室温使其完全溶解(3-5min左右);
2.分离:随后按照裂解液:氯仿(5:1)的比例加入氯仿,剧烈震摇30S(自认为手劲儿大的就手动摇,扛不住的话也可以涡旋仪,当然我是一直手动的哈哈)后,室温静置3min,4℃,13,000rpm离心10min,取上清置于干净的RNAfree的EP管中。【小提示:取上清的时候很容易将中间层的絮状物吸出,导致蛋白质污染,可以采用PhaseLockGel的离心管,有效分层水相和有机相,避免吸取的上清混杂杂质。】
3.沉淀:在上清中加入等体积的异丙醇,轻微上下翻动混合,冰上孵育20min后,4℃,14,000rpm离心20min,管底部有可见沉淀,即为RNA(如果裂解的细胞较少,沉淀可能肉眼看不见)。
4.清洗干燥:轻柔的倒掉上清,每管加入1ml75%乙醇溶液(采用DEPC水配置),混匀,4℃,14,000rpm离心15min。小心倒掉上清,于超净台边缘干燥5min。
5.溶解测定:根据具体的RNA的量,加入适当的DEPC水溶解(沉淀可见,加入的DEPC水多一些,反之少加),静置后即可于Nanodrop检测浓度(一般我们暂定A260/A280比值在1.8-2.0即可使用)。
说了这么多终于完成了第一大步,虽然步骤看似较多,但是掌握后还是蛮简单的,而且在做该步骤的时候还可以穿插很多其他的实验,非常不占用时间。
在小笔的实验中,采用的是TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix试剂盒,只需要根据试剂盒说明书的配比加入八连排管,设置好程序即可。
当然,每个实验室使用的试剂盒不同,具体根据各自实际情况来定,但是原理是相同的,最终得到cDNA产物即可,储存于-20℃备用。
RT-PCR
这部分其实是最简单也是最难的一步,简单在于只要把相应的引物,cDNA产物,SubGreen染料等以合适的比例混合在一起即可;而难点在于加样的精准性,会极大的影响实验的结果。
我以ABI7500fast为例,采用subgreen荧光染料,按照以下反应体系进行配比:
序号 | 反应物 | 剂量μL |
1 | 上游引物Forward | 0.6 |
2 | 下游引物Reverse | 0.6 |
3 | SubGreen染料 | 10 |
4 | cDNA | 5 |
5 | DEPC水 | 3.8 |
总 | 20μL |
反应温度为:
95℃预变性3min,随后40个PCR循环(95℃3seconds;60℃31secends),最后加上溶解曲线即可。
最后得出以上这样的曲线,如何解读下期说啦。
备注:因为ABI的这台仪器可以全自动分析实验数据,操作较为简单。其他仪器要根据相应的操作手册来进行,要注意各自的反应体系和温度设置,不同仪器会略有差异。
最后几点重要的小提示:
1.最后进行PCR后的PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳来检测其产物是否是单一的扩增条带,小笔比较懒,较少采用该步骤。
2.PCR引物的设计也是十分重要的环节。设计不合理,很容易P出不对的结果或者根本P不出来,下次有时间再专门讲解如何设计合适的引物。
3.最最重要的是,提取RNA的所有的操作过程都要保证无污染,比如使用RNAfree的EP管,采用DEPC水,戴口罩和手套等等;PCR的过程要保证精准度,新手可能一次性加满96孔板会导致复孔结果偏差很大,先少后多,保证质量,相信我,不然一溜加完加到手酸无比,也出不来好的结果的时候,你会崩溃的。
RT-PCR从收细胞开始到最后出结果,看似时间很长,但是可以一次得到很多结果,还是属于高效性的实验,只要把握实验的关键技术难点,出数据是分分钟的事情,好啦,啰嗦到此,诸位使出洪荒之力好好做实验吧,如果在实验中太辛苦,生不如死的话,找我找我来帮你,哈哈哈!
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