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Anaspec/Glucagon - Like Peptide 1, GLP - 1 amide, human/0.5 mg/AS-22460
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Anaspec/Glucagon - Like Peptide 1, GLP - 1 amide, human/0.5 mg/AS-22460
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Anaspec
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AS-22460
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DescriptionSequence(One-Letter Code)
Product NameGlucagon - Like Peptide 1, GLP - 1 amide, humanHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR - NH2
Size0.5 mg
Catalog #AS-22460
US$$186
Purity% Peak Area By HPLC ≥ 95%

In response to Glucose ingestion, proglucagon in the intestinal L cells is cleaved into GLP-1 (1-36).Prior to secretion into the circulation, GLP-1 (1-36) is further processed into amidated GLP-1 (7-36)-cat# AS-22462-and small amounts of glycine-extended GLP-1 (7-37)-cat# AS-20761.Both GLP-1 (7-36) andGLP-1 (7-37), causes glucose dependent release of insulin by pancreatic beta-cells. They also play a role in gastric motility (gastric emptying), on the suppression of plasma glucagon levels (glucose production) and possibly on the promotion of satiety and stimulation of glucose disposal in peripheral tissues independent of the actions of insulin. GLP-1 peptides such as GLP-1 (1-36) have been used to investigate restoration of pancreatic beta cell function. GLP-1 is also produced in the central nervous system.

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Detailed InformationDatasheet
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Storage-20°C
ReferencesDrucker, D. et al. Proc Natl Acad Sci USA 84, 3434 (1987) Kieffer, T. and J. Habener, Endo Rev 20, 876 (1999)Deacon, CF. et. al. Hormone Metabolic Res 36,761 (2004), doi: 10.1055/s-2004-826160Williams, JA. Pancreadepedia (2014), doi: 10.3998/panc.2014.7.
Molecular Weight4111.5
HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
Sequence(Three-Letter Code)H - His - Asp - Glu - Phe - Glu - Arg - His - Ala - Glu - Gly - Thr - Phe - Thr - Ser - Asp - Val - Ser - Ser - Tyr - Leu - Glu - Gly - Gln - Ala - Ala - Lys - Glu - Phe - Ile - Ala - Trp - Leu - Val - Lys - Gly - Arg - NH2
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抗原的具体分类123
nhwjszgq2018-01-10
文献资料 - 医学书籍 - 医学免疫学
第四节 抗原的分类

一、天然抗原

根据抗原性物质与机体的亲缘关系可分为“自己”(self)与“非已”(non-self)抗原。即与机体种系发生关系愈远,其遗传性差异越大,其免疫原性也愈强。

(一)“自己”抗原

正常自身组织成分及体液组分处于免疫耐受状态,不能激发免疫应答,但如打破自身耐受,则可引起自身免疫应答;另一些自身组织成分虽具有免疫原性,但在正常情况下,由于组织屏障,不能进入血流,因此不能与免疫细胞接触,也不能激发免疫应答,称此种抗原为隐蔽性身抗原,如脑组织、眼晶状体蛋白及精子等。一旦因外伤或手术等原因,可使此种抗原进入血流时,则可引起自身免疫应答。受病原微生物的感染或应用某些化学药物,可与自身组织蛋白结合,改变其分子结构,形成修饰的自身抗原,也能引起免疫应答。

(二)非已抗原

来自异种动物的抗原物质称为异种抗原。如来自外部侵入人体的各种病原微生物及其产物的外毒素,注射的异种动物免疫血清,以及吸入和食进的异种蛋白,例如花粉和食物均属异种抗原。由于与人种属关系远为强免疫原。此外癌细胞可在人体内产生特异性癌抗原,但对其免疫原性迄今尚未能证实。

在同种动物不同个体间也存在各种组织成分抗原性的差异,称此种抗原为同种异型抗原。这种抗原受遗传支配,它可在遗传性不同的另一些个体内引起免疫应答,称之为异型免疫应答。如人血型抗原不同输血时可引起输血反应,组织相容性抗原或移植抗原型不同可引起移植排斥反应。此外,免疫球蛋白分子上存在的Gm、Am、Km标记均属异型抗原,可用以鉴别IgG、IgA及K轻链的异型。

在不同种属动物组织间也可发现有共同抗原,称这种抗原为异嗜性抗原。Forssman首先发现这种抗原,故亦称之为Forssman抗原。即这种抗原无种属特异性,它可共同存于人、不同种动物与微生物之间,因此它与疾病的发病学和诊断有一定意义。

目前已发现多种异嗜性抗原,如大肠杆轿O86含有人的B血型物质,肺炎球菌14型含有人A血型物质,它们与人血型抗体的产生有关。有些病原微生物与人体某些组织具有共同抗原成分,是引起免疫性疾病的原因之一。如溶血性链球菌一些抗原可与肾小球基底及心肌组织有有共同抗原成分,它们可能与急性肾小球肾炎和风湿病的发病有关。又如大肠杆菌O14型脂多糖与人结肠粘膜有共同抗原,可能与溃疡性结肠炎的发病有关。

某些疾病的诊断也可借助于对异嗜性抗原的检测。例如引起原发性非典型肺炎的病原支原体与MG株链球菌有共同抗原,可藉其血清中抗体对此种链球菌的凝集反应进行诊断,引起斑疹伤寒的立克次体与变形杆菌一些菌株间有共同抗原,可藉其血清中抗休对变型杆菌的的凝集反应进行诊断,称之为Weil-Felix反应。此外传染性单核细胞增多症患者血清中,可出现凝集羊红细胞的异嗜性抗体,可用羊红细胞凝集反应进行诊断。

二、人工抗原

用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学结构决定簇的抗原,称之为人工抗原。它可包括人工结合抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。无论对免疫学理论研究和分子疫苗的制备都具有重要意义。

(一)人工结合抗原

将无免疫原性的简单化学基团与蛋白质载体偶联,或将无免疫原性的有机分子如二硝基苯(DNP)或三硝基苯(TNP)与蛋白质载体结合,形成载体-半抗原结合物,均属人工结合抗原。应用此种抗原证明了抗原与抗体特异结合的化学基础,以及在抗体生成过程中T与B细胞的协同作用。

(二)人工合成抗原

用化学方法将活化氨基酸聚合,使之成为合成多肽,只由一种氨基酸形成的聚合体称为同聚多肽,如由左旋赖氨酸形成的共同聚多肽(PLL)。由二种或二种以上氨基酸形成的聚合多肽称为共聚多肽,如由酪氨酸、谷氨酸与多聚丙氨酸和赖氨酸组成的聚合成多肽(T、G)-AL。应用这种人工合成多肽可研究氨基酸种类、序列与蛋白质抗原性及免疫原性的关系,也可研究机体遗传性与免疫性的关系。
对天然蛋白质抗原性的研究证明,任何一个氨基酸片段,只要具有合适的构型,都有抗原性,甚至一小段合成的小肽与合适的载体相联接,也能诱导产生抗体,并能与其天然分子构型相结合,这就提示,可根据天然蛋白质抗原的免疫原性片段进行氨基酸序列分析,或由其编码DNA推导的氨基酸序列,进行构建人工合成多肽疫苗。
(三)基因工程抗原

近年来由于分子生物学技术的进步,已有可能将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并与适当载体(如细菌粒或病毒)DNA分子相结合,然后引入受体细胞中(如原核细胞的大肠杆菌或真核细胞酵母菌及哺乳类动物细胞)使之表达,即能获得免疫原性之融合蛋白,经纯化后可做为疫苗,此即基因工程疫苗。

应用分子生物学技术制备基因重组疫苗的另一进展,是将目的抗原决定簇的DNA序列插入另一种比较安全的活病素基因组中(如牛痘苗),制备所谓重组感染载体多价疫苗。

随着70年代分子病毒学的发展,特别是对病毒基因的结构、功能与复制方面知识的积累,为迅速研制病毒亚单位疫苗、合成多肽苗以及基因工程疫苗奠定了基础。

一些重要病毒如乙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒以及流感病毒等的蛋白质多肽,都已利用基因工程进行了成功的表达,有的已进入临床试验阶段。我国也报导了正在进行研制基因工程乙型肝炎病毒疫苗和在牛痘苗表达系统中研制乙肝病毒的重组感染载体的多价疫苗。

三、胸腺依赖抗原与胸腺非依赖抗原

实验证明,由抗原激发的免疫应答是多细胞相互作用的结果,即由抗原呈递细胞、T细胞和B细胞共同参与予完成的。大多数抗原激发的体液免疫应答,必须有TH细胞参予才能完成,称这种抗原为胸腺依赖抗原(thymus-dependent antigen,TD Ag)。但也有少数抗原物质,不须TH细胞参予,可单独刺激B细胞产生抗体,称这种抗原为胸腺非依赖抗原(thymus independent antigen,TIAg)。这二种抗原的区别主要在于其抗原决定簇的结构不同所致。TD抗原在其分子结构上,既具有载体功能的决定簇,也具有抗原性决定簇。且在其分子表面出现多种不同抗原决定簇,但缺乏重复出现的同一决定簇,TD抗原主要是大分子蛋白质。而TI抗原多数为大分子多聚体,带有重复出现的同一抗原决定簇,且降解缓慢,故不须TH参加即能直接刺激B细胞,TI抗原主要是多糖类物质(图10-5、表10-5、6)。

图10-5 TD与T1抗原种类

表10-5 TD与TI抗原种类

TD TI
人丙种球蛋白

牛血清清蛋白

卵白蛋白

类毒素
羊红细胞

组织相容性抗原等
肺炎球菌荚膜多糖

脂多糖

聚合鞭毛

DNP-聚蔗糖

聚乙烯基吡络烷酮(PVP)

表10-6 TD抗原与TI抗原的特性

特性 TD抗原 TI抗原

TⅠ-1 TⅠ-2

化学特性 蛋白质 脂多糖 多糖
抗体应答 + +
无胸腺鼠 - + -/少
无T细胞培养物 -
抗体应答的特点 -
类别转换 + - -
亲和性成熟 + - -
记忆B细胞 + - -
多克隆B细胞活化剂作用 - + -
诱导DTH能力 + - -

四、超抗原

(一)超抗原的概念

超抗原(supper antigen,Sag)是一类由细菌外毒素和逆转录病毒蛋白构成的抗原性物质。它们能与多数T细胞结合并为T细胞活化提供信号。而上述的普通抗原只能与少数对应T细胞结合并使之活化。因此称这种能与多数T细胞结合的抗原为超抗原。

(二)超抗原与T细胞结合的特征

超抗原主要与CD4+T细胞结合,而和普通抗原肽与T细胞的结合有很大差异。超抗原既能与APC细胞上MHCⅡ类分子结合,也能与TCR Vβ链结合是其作用特点。

超抗原无需经APC加工可直接与MHCⅡ类分子非多态区外侧结合,而不是与肽结合沟结合,故无MHc 限制性。

在T细胞方面超抗原只与TCR Vβ片段结合,而与D和J区无关,也与TCRα链无关。任一已知超抗原能与其特殊殊的Vβ片段结合,所以一种超抗原可活化多数T细胞,约占T细胞库的1/20~1/5,这远远超过普通抗原活化T细胞的数量(表10-7)。

表10-7 超抗原的作用特性

普通抗原 超抗原
T细胞一次应答 - +
T细胞反应频率 1/106~1/104 1/20~1/5
MHCⅡ类分子 肽结合沟 非多态区(α-螺旋)
结合部位 外侧
MHC限制性 + -
APC存在 +

(三)超抗原的种类

1.内源性超抗原(病毒性) 70年代初Festenstein发现在MHC相同,而MHC以外基因区不同的纯系鼠间进行淋巴细胞混合培养,可引起很强的T细胞增殖反应,将刺激这种增殖反应的抗原称为次要淋巴细胞刺激抗原(minor lymph'ocyte stimulating antigen,Mlsag)。

近年来证明这种内源性MLs抗原是小鼠乳腺肿瘤病毒(mouse mamary umor virus,MMTV)产生的蛋白。MMTV是一种逆转录病毒,以前病毒(provirus)形式整合于小鼠细胞DNA中。这种小鼠可终生制造这种病毒蛋白,因之可视为一种自身超抗原。这种小鼠内源性MLs抗原的化学性质现已证明是一种糖蛋白。

由于MLs抗原的来源已经清楚,故目前称这种小鼠的内源性超抗原为病毒性超抗原。人类是否也有这种病毒性超抗原,目前尚不能肯定,但有人提出人类免疫缺损病毒(HIV)也是逆转录病毒,有可能是人类的病毒性超抗原。

2.外源性超抗原(细菌性)外源性超抗原是一类细菌性外毒素组成,主要由革兰氏阳性细菌产生。如金黄色葡萄球菌产生的肠毒素(staphylococcus enterotoxin,SE)以及链球菌产生的致热外毒素等。

(四)超抗原的生物学意义

1.超抗原与T细胞的耐受诱导 实验证明在胸腺内分化发育中的T细胞如与超抗原结合,可诱发程序性细胞死亡,导致克隆排除。用抗Vβ单克隆抗体在周围血中检测不出带有特殊Vβ受体的T细胞,为T细胞耐受诱导机制的研究提供了有力的实验模式。

2.超抗原与疾病葡萄球菌感染所产生的外毒素主要是可溶性蛋白分子,近年来的研究证明葡萄球菌外毒素对靶细胞并无直接毒性作用,而是通过活化多数T细胞所释放的大量细胞因子产生的生物学效应引起的毒性休克综合征等临床征状。

一些疾病,例如原因不明的川畸病,风湿性关节等疾病,发现与某些Vβ阳性T细胞的增殖相关。周围组织中存在的自身反应性T细胞克隆可为外源性超抗原激活而引发自身免疫病。也有学者认为HIV引发的人艾滋病,其发病学与其超抗原相关。
使用大动物血液生产血清白蛋白大概有五方面优点:技术要求较低; 产量大(如果养殖规模大的话); 可以反复生产(抽完一次血过一个时期又可以抽); 目的蛋白组分及结构较明确(相对于重组细菌发酵生产白蛋白来说);生产方法固定(参见药典,或相关生产GMP).
事实上,现在多数药用级别白蛋白都是用血清生产的.
白蛋白的销售方向若是面向实验室,可采用重组质粒转到微生物发酵的方法生产,对土地面积的要求小,更集约,成本效率更高.
特异多糖即O抗原的缺失会有细菌从滑型到粗糙型的改变

我的细胞复苏的时候染菌了,还能不能用来测胞内细胞因子IFN-γ,谢谢大家,帮帮忙。

蛋白质重组,先要全部水解为氨基酸,蛋白质的种类多就是因为它的数量大,结构复杂,空间结构千变万化。而基本的氨基酸只有20中,所以它重组以后就可能变成完全不同的东西,控制和以前完全无关的代谢过程。
基因重组只是控制同一性状表达不同而已,但是它不会改变性状的基本情况。如:控制眼睛颜色的基因,亲本的基因重组之后可能亲本为黑色,子代便为蓝色。但绝对不会控制眼睛颜色的基因在重组之后就变成控制耳朵的基因。
人体共有三道防线:第一道防线是由皮肤和黏膜构成的,他们不仅能够阻挡病原体侵入人体,而且它们的分泌物(如乳酸、脂肪酸、胃酸和酶等)还有杀菌的作用第二道防线是体液中的杀菌物质和吞噬细胞这两道防线是人类在进化过程中逐渐建立起来的天然防御功能,特点是人人生来就有,不针对某一种特定的病原体,对多种病原体都有防御作用,因此叫做非特异性免疫(又称先天性免疫)第三道防线主要由免疫器官(胸腺、淋巴结和脾脏等)和免疫细胞(淋巴细胞)组成的。
第三道防线是人体在出生以后逐渐建立起来的后天防御功能,特点是出生后才产生的,只针对某一特定的病原体或异物起作用,因而叫做特异性免疫(又称后天性免疫)。后天性免疫--免疫的第三道防线免疫的第三道防线:特异性免疫。主要由免疫细胞--淋巴B、淋巴T细胞进行免疫。其中,淋巴B细胞“负责”体液免疫;淋巴T细胞“负责”细胞免疫。后天性的特异性免疫系统,是一个专一性的免疫机制,针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞分泌的抗体,只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。第1、2防线,就好比杀毒软件本体;第3到防线就好比病毒/木马专杀软件。只有3道防线同时、完整、完好发挥免疫作用,我们的身体健康才能更充分的得到保证。展开

RT,有人添加b27,有人不加,这是为什么?应该以什么为标准呢?


EGF用0.1%BSA稀释后加入培养液是否违法无血清的原则?



植物生物反应器是指通过基因工程途径,以常见的农作物作为“化学工厂”,通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂的方法。随着新功能基因的分离、克隆以及各种农作物高效表达技术平台的逐步建立,在今后15至20年内,将会有相当数量的高新生物技术产品不断涌现并与消费者见面。这种“分子农业”的出现及普及将会对我国现有的农作物种植结构产生显著影响,对增强我国农产品的竞争能力、极大的提高农民的收入以及维护农业的可持续发展具有重要意义。同时,也有利于形成新的产业链,培育出较大的产业集团。

一、国外植物生物反应器研究概况

与石油和煤炭等矿物不同,植物是一种多样化、低成本和可再生的生物资源。植物通过自身光合作用积累的各类生物大分子,如碳水化合物、纤维素、蛋白质和脂肪酸等,不仅为人类和动物提供了赖以生存所需要的各种食物,同时还提供了大量非食用性的化工产品。而生物技术特别是在基因工程研究领域内的快速进展则使人类进一步拓宽了植物的应用范围。国外发达国家特别是美国采用植物生物反应器这种“分子农业”的方法,已经成功地生产出多种高新生物技术产品,包括特殊的饱和或不饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精或糖醇、次生代谢产物、工农业用酶以及一些高经济附加值的药用蛋白多肽,一些研究机构和公司已经开始从这些产品生产中获得巨大的经济效益(见附件1)。

在植物生物反应器研究中,最受人们关注同时研究进展也最快的是生产各种疫苗用的抗原蛋白。病毒和细菌性传染病是威胁全球人类健康及生活质量最重要的因素之一,自古以来,人们就不断寻求各种方法对付这些传染性疾病。1778年,英国人Jenner首次发现人接种牛痘可预防天花病毒传染,在此后的时间里,疫苗已被证明是对付传染性疾病特别是病毒性传染病最为经济和有效的方法。

现在,人们通过接种疫苗已完全根除了天花,并在全球范围内基本控制了脊髓灰质炎、狂犬病、破伤风、白喉、百日咳和乙型脑炎等多种病毒及细菌性传染病的发生和传播。疫苗的形式也由菌体疫苗发展到亚单位疫苗(Subunitvaccine),甚至还产生了DNA疫苗。但是,目前人们使用的疫苗还主要是通过微生物发酵或动物细胞组织培养获得的,需要复杂的生产设备,生产工序繁琐,生产成本较高,不易保存和运输,因此,这些疫苗在经济落后的发展中国家推广起来比较困难,普通人群不易接受。此外,有些疫苗还存在着安全性和使用不便等方面的问题。

1992年,美国人C.J.Arntzen和H.S.Mason率先提出了用转基因植物生产疫苗的新思路。此后,国内外多个实验室相继在烟草、马铃薯、番茄、苜蓿和莴苣中表达了乙肝表面抗原、大肠杆菌热敏毒素B亚基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒壳蛋白和狂犬病毒G蛋白等抗原,并利用在植物中表达的抗原进行了动物和人体的免疫实验,获得了大量有价值的研究数据,为今后利用转基因植物生产疫苗奠定了良好基础(见附件2)。

植物来源的重组药用蛋白第一次临床应用研究是由星球生物技术有限公司(PlanetBiotechnology,Inc)报道的,该公司位于美国加利福尼亚境内。该公司利用转基因烟草中表达的抗体sIgA生产新药CaroRxTM,主要目的是预防和治疗由细菌引起的龋齿。临床实验证实CaroRxTM可以有效清除人口腔内的变异链球菌(S.mutans)并预防志愿者口腔产生龋齿。该公司也正在设计和开发一些新的sIgA抗体,用来有效预防口腔、呼吸道、消化道,生殖和尿道等粘膜系统和皮肤受到一些传染性病菌和毒性因子的感染。

美国著名的孟山都公司(Monsanto)已经培育出一种转基因玉米,每公顷玉米可以产生3.7公斤达到药用蛋白标准的人类抗体。假如每公顷的玉米产量可达8.6吨的话,在重组蛋白产量方面还具有相当大的改善空间。临床医学研究者计划向每个癌症患者注射250毫克这种玉米种子来源的抗体蛋白药物。孟山都公司还在种植一种转基因大豆,这种大豆可以生产针对单纯疱疹病毒2(HSV-2)的人源化抗体,这种抗体的动物试验表明它可以阻止HSV-2在小鼠阴道内的传播。植物来源的抗体在体外的稳定性和体内的生物活性与动物细胞培养来源的抗体是相同的,利用它将开发出一种低成本的治疗方法来防治某些由性传播的疾病。

美国的ProdiGene公司和EPIcytePharmaceuticals公司正计划开展合作,进行玉米生产抗体的开发,主要是生产某些人粘膜抗体用于被动免疫治疗,因为ProdiGene公司在蛋白表达和提取方面具有丰富的经验,而EPIcytePharmaceuticals公司拥有多项相关专利。

LargeScaleBIOLOGy公司和斯坦福大学已经合作开发了一种肿瘤特异性疫苗,可用于阻止细胞的恶性生长,它们利用植物病毒作为瞬时表达系统。研究者们利用修饰后的烟草花叶病毒作为瞬时表达载体,可表达源自38C13鼠B细胞淋巴瘤的型特异的单链抗体。在重组病毒侵染本萨明那烟(N.benthamiana)后,单链抗体蛋白在细胞质外体内可以积累到很高的水平。这种抗体片段可与一种亚型特异的抗抗体反应,这表明植物产生的38C13单链抗体经过了正确的折叠,用经亲合层析纯化的38C13单链抗体免疫后的小鼠可以产生大于10ug/ml的型特异性的抗抗体。这些小鼠可以抵御致死剂量的38C13肿瘤的攻毒试验,其保护效果类似于用38C13IgM-匙蓝蛋白偶联疫苗免疫后的结果。这种产生肿瘤特异性蛋白疫苗的病毒快速表达体系为治疗非何杰金氏淋巴瘤提供了一种可靠的方法。治疗的目的是在患者体内产生特殊的抗体,它能特异性识别恶性生长的B细胞表面特异性位点,使靶细胞最终受到破坏,而正常的细胞不会受到任何影响。

另外一个引起全球关注的研究成果是,瑞士联邦技术研究所的IngoPotrykus教授及其同事在洛克菲勒基金会和欧盟农业研究计划(EuropeanCommissionsAgriculturalResearchProgramme)共同资助下,在2000年将水仙的八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶基因导入水稻,研制出一种富含β胡罗卜素(维生素A前体)的水稻,品种名称T309,每克稻米含1.6mgb胡罗卜素,由于稻米色泽金黄,故称为“金色大米”。发展中国家目前大约有2.5-10亿人患维生素A缺乏症,正是由于此症,这些国家每年有1,000-2,000万儿童死亡。食用富含铁质和维生素A的这种转基因水稻,将大大减少发展中国家儿童贫血症和维生素A缺乏症的发病率。该技术目前已被免费授权给菲律宾国际水稻研究所和印度的一个水稻研究中心,以期培育出适合当地种植的水稻品种,大规模种植可能会在2005年前后开始。



二、国内现有工作基础

我国植物生物反应器的研究始于上世纪90年代初期,虽然在构建高效植物表达载体和培育转基因植物等主要技术环节上与国外相差无几,但在研究的广度和深度上与发达国家相比却存在很大差距。幸运的是,由于国家有关方面已意识到植物生物反应器的重要性,所以在制订“九五”计划时,选择了“利用转基因植物生产口服疫苗和生物可降解塑料”等4个研究课题作为探索性项目而予以资助(见表2-1)。“九五”期末,已获得如下研究成果:

1.将乙型肝炎病毒包膜的蛋白基因导入马铃薯和番茄中,获得了高效表达该外源基因的工程植株,小鼠口服接种实验表明该重组抗原蛋白可诱导特异性的保护性抗体产生,已进入临床应用研究的前期准备阶段,相关转基因植物已进入环境释放阶段。

2.已将产毒素大肠杆菌热敏毒素b亚基及定居因子CS6B抗原蛋白基因导入马铃薯中,获得了高效表达重组抗原蛋白的转基因马铃薯植株,小鼠的口服接种实验证实可诱导特异性保护抗体产生,相关转基因植物已进入环境释放阶段。

3.获得了口蹄疫流行株的基因文库及我国常发生的O型口蹄疫口服疫苗VP1基因,拥有相应的口蹄疫诊断技术和疫苗评价标准,已成功地利用TMV载体大量表达出与TMV外壳蛋白融合的多个口蹄疫病毒表面抗原小肽,可从100克烟草叶片中得到1-2克含口蹄疫病毒“OK1”株系抗原决定小肽(11肽和14肽)的融合蛋白。对模式动物豚鼠进行的免疫实验结果表明,这些融合蛋白小肽具有良好的免疫原性,可作为预防口蹄疫的安全的新一代基因工程疫苗。

4.建立了农杆菌介导的胡萝卜转化系统,已在烟草和胡萝卜中表达了CTB,霍乱毒素b亚单位(CTB)的表达量达到0.1%。通过在CTB基因前导入烟草病程相关蛋白PR1b的信号肽序列,使CTB在烟草中的合成量提高了20多倍,并通过一步亲和层析法从烟叶中提纯了CTB。

上述研究项目在立项前均已进行了专利查新工作,所涉及的基因、植物、外源基因转移方法和高效植物表达载体的构建等关键技术有自己的独创性。从事“863”计划和计划以外其他国内单位和个人为此都申请了国家发明专利,因此,这些研究成果拥有我国自主的知识产权。

通过“九五”的探索性研究,进一步缩短了我国与世界先进国家的技术差距。从表2-2中的数据可以看到,国外普遍应用的植物转基因技术在我国已成功应用,有些技术还为我国所独创,如花粉管通道转基因技术。国外尚在探索的新技术,如使用植物病毒作为瞬时表达载体实现基因高效表达,我国也在探索。因此,应当说我国在利用植物生物反应器技术上已有较好的基础。

在制订“十五”“863”计划时,国家进一步加大了在植物生物反应器研究方面的投资力度。其中“利用植物生物反应器生产动物口蹄疫、结核病等兽用疫苗”、“降钙素和人乳铁蛋白等功能蛋白植物生物反应器的研制”、“组织和器官特异性基因表达启动子研究及高效表达载体构建”、“高效转化系统的研究”和“外源蛋白在受体植物中高效和稳定表达机制的研究”等课题被列为重大课题而予以了资助。这些研究在进行当中,到2005年前后,当上述重大专项主要技术经济指标实现以后,我国医药市场上将出现几种用植物生物反应器生产的药物、疫苗或其他保健食品。

目前,国内在一些植物如马铃薯和玉米等高效表达外源基因的技术上还不是很成熟,从植物中提取和纯化表达产物的技术还有待改进。许多植物病毒可在植株寄主体内大量扩增并表达病毒蛋白,如烟草花叶病毒感染烟草后,其外壳蛋白的含量可达烟草叶片蛋白总量的20%。此外,病毒的提取和外源蛋白的纯化也比较方便,因而只要设计巧妙,就可以用植物病毒载体作为生物反应器,大幅度提高外源基因的表达量。用病毒载体既可表达分子量较大的全长外源蛋白,也可表达与病毒蛋白相融合的多肽。因为大部分病毒载体仍具有感染活性,无须经过植物基因转化过程即可在常规植株体内表达外源基因,所以,用病毒作为植物生物反应器大量生产外源目的蛋白具有广阔的市场前景。

特别应该指出的是,我国植物生物反应器的研究和利用还主要集中在药用蛋白的研究和应用方面。而利用转基因植物生产特殊饱和或不饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精或糖醇、次生代谢产物、工农业用酶制剂的研究仍然没有引起国家足够的重视,其实,这些生物制剂的市场潜力也是非常可观的。国内一些有识之士早已看出了这一点,通过自筹资金或采用国际合作方式开展了前期研究工作,并取得了令人瞩目的研究进展,如利用转基因玉米生产植酸酶,在加工成动物饲料添加剂后,可有效降低家畜排泄物中的磷含量,这对于降低水污染和保护生态环境方面很有意义。



三、植物生物反应器的商业应用前景

在过去15年里,生物技术工业不仅诞生了百亿美元级的公司,而且也成为当今世界商业活动中增长最快的领域之一。生物技术产品的市场非常大,包括了医药、农业、渔业、造纸业和其他许多产业。据统计,从上世纪80年代至今,通过DNA重组技术所生产的生物医药年销售额已超过100亿美元。由于生物医药产业被许多国家视为强劲的经济增长点而加以重点扶持,生物医药的年销售规模将从1996年的101亿美元扩大到2006年的320亿美元,平均年增长率将达12%以上,其中治疗药物年平均增长16%,诊断试剂年平均增长9%。

美国是现代生物技术发展较早和较快的国家,1994年,美国生物技术药品年销售额为50多亿美元,至2001年,美国生物技术产品在全球市场上的销售额达200亿美元,占到全球总市场的约90%以上。此外,美国还拥有世界上约一半的生物技术公司和一半的生物技术专利。迄今为止,获得美国FDA批准上市的治疗类生物技术药品共16种,另外约有400多种生物诊断试剂在临床中应用。

欧共体国家是世界第二大医药市场,自身对生物技术产品的需求是巨大的,但它的生物医药研究滞后于美国,因此,欧共体国家正在加大对生物技术研究的投入,以提升其生物技术产业在国际市场上的地位和市场占有份额。进行同样努力的国家还包括***、加拿大和澳大利亚等一些发达国家。

我国现有500多家生物技术公司,但与西方发达国家相比,我国生物医药研究和产业化起步都比较晚。从1989年我国第一个生物工程药物β干扰素上市到2001年底,我国现有乙肝疫苗、促红细胞生成素(EPO)、人胰岛素、人生长素、细胞集落刺激因子(CSF)等15种基因工程药品投入市场。1997年,我国生物医药全年的产值达到125亿元,占整个医药工业的8.9%。

以EPO为例,它目前是世界上临床疗效最显著、销售额最可观的一种生物技术产品,销售利润多年来一直排在生物医药类产品的前三名,每年的增长率在10%以上。目前国内有十几家公司在生产EPO,年生产能力超过了500万支。由于受超额利润的诱惑,已有众多厂家介入这个市场,由于企业竞争过度,导致产品价格下降,利润摊薄。1999年1月11日,国家新药研究与开发协调小组在《生物医药工程产业行动纲要》中指出,国家和企业各方应大力培育生物医药工程产业,使之保持15-20%的年增长率,到2005年生物医药工业年总产值要达到400-500亿元,到2015年总产值达到1,100-1,300亿元。要达到此目标,需不断开发新的生物医药产品,另外,通过研制新的表达系统,增强表达效率和降低生产成本,对提高产品销售利润也非常重要。

目前,利用重组DNA技术生产的大多数治疗用血液蛋白几乎都是在哺乳动物细胞表达系统中生产出来的。该系统的主要优点是所表达的重组蛋白能够进行正确的折叠及完成其他翻译后加工过程的机会比较高,然而,有许多因素仍然限制哺乳动物细胞表达系统的广泛应用,这些因素包括:

1)即使在最适的培养条件下,重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平仍很低,通常为每天每升数十毫克;

2)重组蛋白最后必需从培养液中分离提纯出来,这会进一步导致产量损失和增加生产成本;

3)哺乳动物细胞表达系统日常维护费用非常高,这也使产品的生产成本居高不下;

4)哺乳动物细胞对外力比较敏感,而振荡培养通常又是工业化大规模生产所不可缺少的,这就使扩大生产规模变得相当困难;

5)胎牛血清是哺乳动物细胞生长所不可缺少的,它的价格昂贵,而且不同批次之间成份相差很大,这些变化会导致细胞的生长情况不一致,进而影响到细胞发酵过程及下游的提纯加工过程;

6)哺乳动物细胞对一些环境因素如温度、pH值、含氧量和次生代谢产物的变化非常的敏感,因此需要对培养条件进行精确的监控;

7)利用哺乳动物细胞培养表达系统不能避免病原生物的污染。

由于存在着上述限制因素,利用植物作为生物反应器生产具有临床应用价值的药用蛋白日益引起人们的关注。尤其是当重组蛋白需求量比较大,供给时间又是长期的话,利用植物表达系统很显然是一个不错的选择,它除了具备其它真核生物表达系统共有的那些优点外,还有一些是其它表达系统所不具备的。例如,利用植物所收获重组蛋白的数量仅仅受到植物种植面积的限制。普通的农业措施就可以产生令人吃惊的生物材料,例如,采用高密度种植的烟草每公顷可以产生170公吨的生物材料。假定在实验室规模所生产的重组蛋白水平在田间生产仍能够保持的话,那么170公吨的材料中有100公吨是叶子,每公顷土地就可以产生50公斤的分泌型抗体IgA或100公斤的重组葡萄糖脑苷脂酶(Glucocerebrosidase)。在表4-1中,列出了一些作物每公顷的生物产量作为重组蛋白生产量的依据。

亲合素(Avidin)在诊断试剂中的应用十分广泛,它是蛋清中比较丰富的一种真核生物蛋白,在常规情况下可从蛋清中直接分离纯化。在转基因玉米中生产这种蛋白并确定它是否能够与蛋清来源的鸡亲合素进行商业化竞争成为研究的理由。一个鸡亲合素蛋白的编码序列被首先按照玉米偏爱的密码子进行优化,然后与大麦α-淀粉酶信号肽编码序列融合并导入玉米染色体中表达。信号肽序列将决定重组蛋白定位在细胞的分泌系统内,而且对于成功表达十分关键,因为定位在分泌系统内的重组亲合素仅会导致玉米部分雄性不育或完全雄性不育,相反,如果亲合素在细胞质溶胶内积累的话,则因有毒性使基因工程玉米完全不能够成活。

每公斤转基因玉米种子可产230mg的亲合素,据估计这种玉米来源的亲合素成本约比蛋清来源的亲合素低10倍。玉米亲合素具有与天然蛋白相同的生物活性,现在成为商品公开出售(见Sigma-Aldrichproduct#A8706)。该研究结果表明:不仅是罕见的蛋白,即使在自然状态下相对丰富的蛋白也可以利用转基因植物以低廉的成本进行生产。利用转基因植物生产的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)也已经商品化,而利用植物生产重组蛋白酶抑制剂Aprotinin的成本也比牛肺来源的天然蛋白要低很多。考虑到重组抗体的天然生产来源不会像生产亲合素的蛋清一样低廉,因此利用转基因植物生产重组抗体所节省的资金将会更多。

人们对生物蛋白医药需求的种类和数量正在不断增加,研究人员必需开发出新的转基因表达生产系统才能满足这种需求,而植物最有希望承担此项任务,如上面所提到的那样,公斤数量的重组蛋白可以从1公顷的转基因烟草中获得。例如,人血清白蛋白全球每年的需求量是550吨,培育转基因动物产生足够量的蛋白满足市场需求需要数年时间,然而,转基因植物可以迅速达到如此生产规模。据估计要满足全世界的需求,一年种植3万公顷的烟草就足够了(假如血清白蛋白表达量占烟草可溶性蛋白的1%),而这一面积仅占到美国总种植面积3,200万公顷的千分之一。



四、未来20年植物生物反应器发展战略

1.农业、农村和农民现阶段面临的问题

改革开放20多年以来,我国农业和农业经济在总体上得到迅速发展,农村居民的收入水平也有了大幅度的提高。1978-2001年,扣除价格因素影响后农村居民人均收入由133元增加到2,352元,年均增加13%。与年收入增长相对应,我国农村居民的生活水平也不断提高,农村的贫困状况得到明显的减缓,贫困人口从1978年的2.5亿下降到2000年的3,000万,年均递减9%。在总体上,中国农村已经摆脱贫困,进入温饱有余的状态。部分地区已经达到小康水平,现在进入全面建设小康社会时期。“九五”以来,我国农业发展步入了一个新的发展时期,但我国农村经济的发展和农民收入的增长遇到了新的瓶颈。基本特征是:农业综合生产能力提高,农产品供求实现了总量平衡,且丰年有余。但由于农产品的需求受到制约,农产品总量的扩张已不能为农民创造更多的就业机会和收入来源,农业增产不增收或增产与增收严重不同步的矛盾比较突出。加入WTO后,我国农产品特别是种植业更是面临发达国家价格低、质量好的产品的激烈竞争,农民的处境更加艰难,因此高度重视农业收益和农民收入问题,千方百计增加农民收入是新时期我国农业和农村工作的重点,也是各级政府部门和农业科技工作者责无旁贷的任务。

近年来,种植业收入的大幅度下降主要不是农产品产量下降的结果。从单位面积的产量来看,除粮食作物在2000年减产外,其他主要作物均有不同程度的提高。以产量衡量的农业生产力在提高,但以收益衡量的生产率却在不断下降。农业这种低效益一方面与宏观经济环境有关,另一方面也与农产品品质不高、不适合市场要求有直接关系。以大豆为例,美国的转基因大豆在出油率和价格上均优于我国的非转基因大豆,所以国内食油加工业舍近求远,宁愿购买美国的转基因大豆,而不愿使用国产的非转基因大豆。

发达国家如美国、欧盟和***等对农民采用政府补贴的方式在我们国家行不通,要增加农民的收入,除了从农业外部做文章,全面免费免税,还必须想方设法增加农民的非农收入来源与渠道,更关键的是要对农业内部进行战略性的结构调整与改变,这才是改变农民地位和生活水平的根本之路。

2.应对措施

为提高农业经济效益和农民收入,增强农产品国际竞争力,应该大力推进农业和农村经济结构的战略性调整,特别是调整农产品的品种与品质结构,在确保粮食供应安全的前提下,将大路产品、低档产品、普通产品、原料性产品为主的生产转向增加优质产品、高档产品、专用产品、功能性产品和高经济附加值产品的生产。

实现上述目标的发展战略之一是国家应从宏观方面加强植物生物反应器的研究与产业化步伐,今后15-20年内,研究重点应该集中在以下几个方面:

1)发掘可供植物遗传转化或病毒载体表达的新药用蛋白基因,拥有我国自主知识产权。随着人们生活水平的提高,由于膳食不均衡带来的人类疾病如肥胖、高血脂、糖尿病和心血管疾病趋于大众化和年轻化,如果在植物中导入这些疾病的抑制蛋白基因,将来人们只需简单食用这些植物或由这些植物制成的新型功能性食品及药物,便可以获得抗病能力。种植这些高经济附加值的转基因作物可迅速带动农民致富,并由此形成新的产业链。以种植马铃薯为例,若每亩可产2,000公斤,每公斤马铃薯1.6元计算,农民每亩收入可达3,200元。若改种抗乙肝的转基因马铃薯,以每200克马铃薯可生产一剂乙肝口服疫苗,2,000公斤马铃薯可生产10,000剂乙肝口服疫苗。以每剂疫苗2元计算,则种植这样一亩马铃薯每亩可收入20,000元。

2)建立高效表达技术平台,提高外源蛋白在植物中的有效成份含量。这直接关系到将来的产业化进程,不仅可以降低生产成本,还可使植物表达系统更具吸引力。要做到这一点,可从两方面入手:一是筛选高效表达的植物启动子,二是选择蛋白含量比较高的植物如豆科植物等。最终目的是使外源蛋白的表达量达到植物总蛋白的1%-5%左右。

3)构建新的植物病毒表达载体系统,使其更易于操作、更稳定、表达效率更高和对生态环境更安全。利用基因工程植物病毒作载体,是生产多种药用蛋白的另外一条重要途径,也是最有希望实现产业化的研究领域之一。如利用病毒载体在植物中生产狂犬病毒疫苗、结核病菌抗原、丙型肝炎和SARS病毒疫苗,其有效性和安全性都将大大提高。

4)如果纯化步骤是必需的,那么如何降低从植物中提取药用蛋白和工农业用酶的生产成本则是首先要考虑的问题。如通过修饰外源蛋白基因,将其定位于植物不同的器官或部位中表达,或采用亲和层析的方法等。

6)除药用蛋白或酶制剂外,考虑利用植物生产其他具有特殊用途的高新生物制剂。如改性淀粉、脂类和其他次生代谢产物。

争取达到如下研究目标:

1)利用植物生物反应器技术生产轮状病毒多价口服疫苗、大肠杆菌(ETEC)和霍乱弧菌口服疫苗、口蹄疫、肺结核等5-10个医用蛋白或疫苗;预防和治疗心血管疾病的新型蛋白药物3-5种;高效表达降钙素、乳铁蛋白和降血压蛋白等3-5种具有保健功能的新型保健食品;工农业用酶5-10个;

2)获得8-10个外源基因表达效率高、组织或器官特异性强并有特殊工业、环保或农用价值的转基因植物株系或载体系统;

3)开展与植物生物反应器相关的新基因、新的生物元件和新技术、新方法研究,进入基因定点整合与植物生物反应器的产业化相配套的关键技术研究,为今后的长期发展奠定工作基础。取得发明专利20-30项,获得专利申请号50-100个;

4)建立3-5个大型的产业化基地并形成相应的产业集团。

我国在现阶段仍是一个发展中国家,不可能像发达国家一样投入巨资进行植物生物反应器的研究和开发,国家主要从政策上予以扶持和协调,特别是鼓励国内大中小企业积极参与,国家也要有重点地选择支持一些研究单位和课题,为此,我们提出如下建议:

1)增加不同学科,特别是医学界和植物分子生物学界科研工作者之间的学术交流,二者优势互补将有利于发掘新的研究课题,加快该领域的研究和研究成果的产业化步伐;

2)制订相应的优惠政策,鼓励企业投资参与研究和开发;

3)在科研经费投入上必须慎重,对开展工作比较好和已有工作基础的的研究单位和课题予以支持,切不能像过去一样一哄而上。投入必须注重回报,获得资助的单位和课题在结题时不能仅以论文和人才培养等借口搪塞,关键是要有直接的经济效益和社会效益。因为这是关系到将来千百万农民是否能够真正脱贫的大问题,因此以风险投资的形式为最好;

4)国家对课题的重视不能仅仅停留在研究阶段,更重要的是关注此后的产业化进程,要给予产业化过程以更大的资金和政策扶持;

5)广泛开展科普教育,提高全民文化素质,使百姓对基因工程及其产品有一个正确的认识。排除心理误区,做到既不一味排斥,也不盲目迷信。否则就会像欧洲国家那样,由于传媒的误导,使大众对所有的转基因产品产生了惧怕心理;

6)国家要在政策上予以强有力的支持,特别是理顺各部门的关系。不能因各部门的利益,而导致政令不通,影响我国研究成果的产业化进程,最终导致国外产品占据国内的绝大部分市场;

7)尽管植物来源的转基因产品,如药物蛋白被认为是最安全的(即具有公认的GRAS状态),但国家应及早制订相应的安全和管理法规,严格规范和监督这类基因工程产品的生产和使用。

专家简介:

刘德虎,男,博士,中国农科院生物技术研究所研究员。1962年12月16日出生。1991年毕业于北京农业大学植物保护系植物病理专业,并获得理学博士学位。同年6月分配到中国农业科学院生物技术研究所工作至今。现主要从事植物分子病毒学及抗病毒基因工程的研究,作为生物技术研究所和农业部重点实验室的青年科技骨干以及中国农业科学院跨世纪学科带头人,曾先后主持承担了国家“863”高新生物技术领域研究项目、国际青年科学基金和国家自然科学基金等8项研究课题。

http://www.caas.net.cn/bioinstitute_v1.0/List.asp?ArticleID=84

附件1下载http://www.biotech.org.cn/news/news/file/20050830093627.doc

附件2下载http://www.biotech.org.cn/news/news/file/20050830093710.doc
是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。它的需要量一般很少。广义的生长因子除了维生素外,还包括碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、C4~C6的分枝或直链脂肪酸,以及需要量较大的氨基酸。生长因子可以用爱¥多¥邦的超声波去除
我想请教一个问题,还望有人能指点一下。
我在准备制备壬基酚(nonylphenol,NP,分子量220.35)的多克隆抗体。现在合成人工抗原NP-BSA,合成过程用到的试剂有:NP、二甲亚砜、BSA、碳酸盐缓冲液、甲醛。现在化学合成已完成,也用PBS进行了透析。我分析透析液中应有NP—BSA,但还可能有BSA之间的交联产物以及甲醛与BSA的交联产物等,且各自能有多大量不能弄清,我想问现在可以用这种透析液对家兔进行免疫了吗?如果可以的话,免疫量每次应为多少?
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