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抗原抗体的结合      体外抗原抗体反应又称血清学反应(serologicreaction),因抗体主要存在于血清中,试验时一般都采用血清标本,故名。但抗原抗体反应亦常用于细胞免疫测定,如对淋巴细胞表面分化抗原的鉴定。因此,血清学一词已被广义的抗原抗体反应所取代。  抗原与抗体在体外结合时,可因抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而出现各种反应,例如凝集、沉淀、补体结合及中和反应等。在此基础上进行改进,又衍生出许多快速而灵敏的抗原 查看更多>
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物质:辣椒红;
结构在附件中。
性质:辣椒红色素为四萜类衍生物,极易溶于植物油、丙酮、己醚、三氯甲烷、正己烷,易溶于乙醇,稍难溶于丙三醇,不溶于水;波长:210-440nm,不耐光和氧。
检测:在卵黄,皮肤,脂肪,肌肉,等组织中原形,同时检测辣椒红素和辣椒玉红素这两种物质。
方法:1.利用琥珀酸酐法对羟基进行改造,再和蛋白偶联;但是左端和右端的羟基有可能都反应,目的是左端连上,如何控制呢?
2.考虑到链太长,找链短,含有类似结构的物质,如与左端一样的,3-羟基视黄醛可以得到。与右端相同的结构仅在CA上看到该物质,没有买的,怎么办呢?按说,应该找到与右端一样的,因右端是两种物质共同的结构。
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辣椒红素的结构.doc(112.5k)
检测动物抗体的就用抗体啦,比如猪瘟病毒抗体检测卡,就是检测猪瘟病毒抗体,是检测做过猪瘟病毒疫苗的免疫监测及该病辅助检测。抗原是检测猪病的, 我们猪场经常用的是 郑州四通畜牧供应的 。
对于人体有两种类型的免疫,一种叫做特异性免疫,就是抗原抗体之间的结合或免疫T淋巴细胞对具有特定抗原的微生物的攻击等。还有一种叫做非特异性免疫,例如皮肤对人体的保护,外分泌腺分泌的液体对外来物质的吸附等等。
可以肯定地说植物没有特异性免疫系统,因为植物没有淋巴细胞;但对于非特异性免疫来说,植物是具备的,例如树皮、树胶等实际上都具有一定的非特异性免疫功能。


植物生物反应器是指通过基因工程途径,以常见的农作物作为“化学工厂”,通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂的方法。随着新功能基因的分离、克隆以及各种农作物高效表达技术平台的逐步建立,在今后15至20年内,将会有相当数量的高新生物技术产品不断涌现并与消费者见面。这种“分子农业”的出现及普及将会对我国现有的农作物种植结构产生显著影响,对增强我国农产品的竞争能力、极大的提高农民的收入以及维护农业的可持续发展具有重要意义。同时,也有利于形成新的产业链,培育出较大的产业集团。

一、国外植物生物反应器研究概况

与石油和煤炭等矿物不同,植物是一种多样化、低成本和可再生的生物资源。植物通过自身光合作用积累的各类生物大分子,如碳水化合物、纤维素、蛋白质和脂肪酸等,不仅为人类和动物提供了赖以生存所需要的各种食物,同时还提供了大量非食用性的化工产品。而生物技术特别是在基因工程研究领域内的快速进展则使人类进一步拓宽了植物的应用范围。国外发达国家特别是美国采用植物生物反应器这种“分子农业”的方法,已经成功地生产出多种高新生物技术产品,包括特殊的饱和或不饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精或糖醇、次生代谢产物、工农业用酶以及一些高经济附加值的药用蛋白多肽,一些研究机构和公司已经开始从这些产品生产中获得巨大的经济效益(见附件1)。

在植物生物反应器研究中,最受人们关注同时研究进展也最快的是生产各种疫苗用的抗原蛋白。病毒和细菌性传染病是威胁全球人类健康及生活质量最重要的因素之一,自古以来,人们就不断寻求各种方法对付这些传染性疾病。1778年,英国人Jenner首次发现人接种牛痘可预防天花病毒传染,在此后的时间里,疫苗已被证明是对付传染性疾病特别是病毒性传染病最为经济和有效的方法。

现在,人们通过接种疫苗已完全根除了天花,并在全球范围内基本控制了脊髓灰质炎、狂犬病、破伤风、白喉、百日咳和乙型脑炎等多种病毒及细菌性传染病的发生和传播。疫苗的形式也由菌体疫苗发展到亚单位疫苗(Subunitvaccine),甚至还产生了DNA疫苗。但是,目前人们使用的疫苗还主要是通过微生物发酵或动物细胞组织培养获得的,需要复杂的生产设备,生产工序繁琐,生产成本较高,不易保存和运输,因此,这些疫苗在经济落后的发展中国家推广起来比较困难,普通人群不易接受。此外,有些疫苗还存在着安全性和使用不便等方面的问题。

1992年,美国人C.J.Arntzen和H.S.Mason率先提出了用转基因植物生产疫苗的新思路。此后,国内外多个实验室相继在烟草、马铃薯、番茄、苜蓿和莴苣中表达了乙肝表面抗原、大肠杆菌热敏毒素B亚基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒壳蛋白和狂犬病毒G蛋白等抗原,并利用在植物中表达的抗原进行了动物和人体的免疫实验,获得了大量有价值的研究数据,为今后利用转基因植物生产疫苗奠定了良好基础(见附件2)。

植物来源的重组药用蛋白第一次临床应用研究是由星球生物技术有限公司(PlanetBiotechnology,Inc)报道的,该公司位于美国加利福尼亚境内。该公司利用转基因烟草中表达的抗体sIgA生产新药CaroRxTM,主要目的是预防和治疗由细菌引起的龋齿。临床实验证实CaroRxTM可以有效清除人口腔内的变异链球菌(S.mutans)并预防志愿者口腔产生龋齿。该公司也正在设计和开发一些新的sIgA抗体,用来有效预防口腔、呼吸道、消化道,生殖和尿道等粘膜系统和皮肤受到一些传染性病菌和毒性因子的感染。

美国著名的孟山都公司(Monsanto)已经培育出一种转基因玉米,每公顷玉米可以产生3.7公斤达到药用蛋白标准的人类抗体。假如每公顷的玉米产量可达8.6吨的话,在重组蛋白产量方面还具有相当大的改善空间。临床医学研究者计划向每个癌症患者注射250毫克这种玉米种子来源的抗体蛋白药物。孟山都公司还在种植一种转基因大豆,这种大豆可以生产针对单纯疱疹病毒2(HSV-2)的人源化抗体,这种抗体的动物试验表明它可以阻止HSV-2在小鼠阴道内的传播。植物来源的抗体在体外的稳定性和体内的生物活性与动物细胞培养来源的抗体是相同的,利用它将开发出一种低成本的治疗方法来防治某些由性传播的疾病。

美国的ProdiGene公司和EPIcytePharmaceuticals公司正计划开展合作,进行玉米生产抗体的开发,主要是生产某些人粘膜抗体用于被动免疫治疗,因为ProdiGene公司在蛋白表达和提取方面具有丰富的经验,而EPIcytePharmaceuticals公司拥有多项相关专利。

LargeScaleBIOLOGy公司和斯坦福大学已经合作开发了一种肿瘤特异性疫苗,可用于阻止细胞的恶性生长,它们利用植物病毒作为瞬时表达系统。研究者们利用修饰后的烟草花叶病毒作为瞬时表达载体,可表达源自38C13鼠B细胞淋巴瘤的型特异的单链抗体。在重组病毒侵染本萨明那烟(N.benthamiana)后,单链抗体蛋白在细胞质外体内可以积累到很高的水平。这种抗体片段可与一种亚型特异的抗抗体反应,这表明植物产生的38C13单链抗体经过了正确的折叠,用经亲合层析纯化的38C13单链抗体免疫后的小鼠可以产生大于10ug/ml的型特异性的抗抗体。这些小鼠可以抵御致死剂量的38C13肿瘤的攻毒试验,其保护效果类似于用38C13IgM-匙蓝蛋白偶联疫苗免疫后的结果。这种产生肿瘤特异性蛋白疫苗的病毒快速表达体系为治疗非何杰金氏淋巴瘤提供了一种可靠的方法。治疗的目的是在患者体内产生特殊的抗体,它能特异性识别恶性生长的B细胞表面特异性位点,使靶细胞最终受到破坏,而正常的细胞不会受到任何影响。

另外一个引起全球关注的研究成果是,瑞士联邦技术研究所的IngoPotrykus教授及其同事在洛克菲勒基金会和欧盟农业研究计划(EuropeanCommissionsAgriculturalResearchProgramme)共同资助下,在2000年将水仙的八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶基因导入水稻,研制出一种富含β胡罗卜素(维生素A前体)的水稻,品种名称T309,每克稻米含1.6mgb胡罗卜素,由于稻米色泽金黄,故称为“金色大米”。发展中国家目前大约有2.5-10亿人患维生素A缺乏症,正是由于此症,这些国家每年有1,000-2,000万儿童死亡。食用富含铁质和维生素A的这种转基因水稻,将大大减少发展中国家儿童贫血症和维生素A缺乏症的发病率。该技术目前已被免费授权给菲律宾国际水稻研究所和印度的一个水稻研究中心,以期培育出适合当地种植的水稻品种,大规模种植可能会在2005年前后开始。



二、国内现有工作基础

我国植物生物反应器的研究始于上世纪90年代初期,虽然在构建高效植物表达载体和培育转基因植物等主要技术环节上与国外相差无几,但在研究的广度和深度上与发达国家相比却存在很大差距。幸运的是,由于国家有关方面已意识到植物生物反应器的重要性,所以在制订“九五”计划时,选择了“利用转基因植物生产口服疫苗和生物可降解塑料”等4个研究课题作为探索性项目而予以资助(见表2-1)。“九五”期末,已获得如下研究成果:

1.将乙型肝炎病毒包膜的蛋白基因导入马铃薯和番茄中,获得了高效表达该外源基因的工程植株,小鼠口服接种实验表明该重组抗原蛋白可诱导特异性的保护性抗体产生,已进入临床应用研究的前期准备阶段,相关转基因植物已进入环境释放阶段。

2.已将产毒素大肠杆菌热敏毒素b亚基及定居因子CS6B抗原蛋白基因导入马铃薯中,获得了高效表达重组抗原蛋白的转基因马铃薯植株,小鼠的口服接种实验证实可诱导特异性保护抗体产生,相关转基因植物已进入环境释放阶段。

3.获得了口蹄疫流行株的基因文库及我国常发生的O型口蹄疫口服疫苗VP1基因,拥有相应的口蹄疫诊断技术和疫苗评价标准,已成功地利用TMV载体大量表达出与TMV外壳蛋白融合的多个口蹄疫病毒表面抗原小肽,可从100克烟草叶片中得到1-2克含口蹄疫病毒“OK1”株系抗原决定小肽(11肽和14肽)的融合蛋白。对模式动物豚鼠进行的免疫实验结果表明,这些融合蛋白小肽具有良好的免疫原性,可作为预防口蹄疫的安全的新一代基因工程疫苗。

4.建立了农杆菌介导的胡萝卜转化系统,已在烟草和胡萝卜中表达了CTB,霍乱毒素b亚单位(CTB)的表达量达到0.1%。通过在CTB基因前导入烟草病程相关蛋白PR1b的信号肽序列,使CTB在烟草中的合成量提高了20多倍,并通过一步亲和层析法从烟叶中提纯了CTB。

上述研究项目在立项前均已进行了专利查新工作,所涉及的基因、植物、外源基因转移方法和高效植物表达载体的构建等关键技术有自己的独创性。从事“863”计划和计划以外其他国内单位和个人为此都申请了国家发明专利,因此,这些研究成果拥有我国自主的知识产权。

通过“九五”的探索性研究,进一步缩短了我国与世界先进国家的技术差距。从表2-2中的数据可以看到,国外普遍应用的植物转基因技术在我国已成功应用,有些技术还为我国所独创,如花粉管通道转基因技术。国外尚在探索的新技术,如使用植物病毒作为瞬时表达载体实现基因高效表达,我国也在探索。因此,应当说我国在利用植物生物反应器技术上已有较好的基础。

在制订“十五”“863”计划时,国家进一步加大了在植物生物反应器研究方面的投资力度。其中“利用植物生物反应器生产动物口蹄疫、结核病等兽用疫苗”、“降钙素和人乳铁蛋白等功能蛋白植物生物反应器的研制”、“组织和器官特异性基因表达启动子研究及高效表达载体构建”、“高效转化系统的研究”和“外源蛋白在受体植物中高效和稳定表达机制的研究”等课题被列为重大课题而予以了资助。这些研究在进行当中,到2005年前后,当上述重大专项主要技术经济指标实现以后,我国医药市场上将出现几种用植物生物反应器生产的药物、疫苗或其他保健食品。

目前,国内在一些植物如马铃薯和玉米等高效表达外源基因的技术上还不是很成熟,从植物中提取和纯化表达产物的技术还有待改进。许多植物病毒可在植株寄主体内大量扩增并表达病毒蛋白,如烟草花叶病毒感染烟草后,其外壳蛋白的含量可达烟草叶片蛋白总量的20%。此外,病毒的提取和外源蛋白的纯化也比较方便,因而只要设计巧妙,就可以用植物病毒载体作为生物反应器,大幅度提高外源基因的表达量。用病毒载体既可表达分子量较大的全长外源蛋白,也可表达与病毒蛋白相融合的多肽。因为大部分病毒载体仍具有感染活性,无须经过植物基因转化过程即可在常规植株体内表达外源基因,所以,用病毒作为植物生物反应器大量生产外源目的蛋白具有广阔的市场前景。

特别应该指出的是,我国植物生物反应器的研究和利用还主要集中在药用蛋白的研究和应用方面。而利用转基因植物生产特殊饱和或不饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精或糖醇、次生代谢产物、工农业用酶制剂的研究仍然没有引起国家足够的重视,其实,这些生物制剂的市场潜力也是非常可观的。国内一些有识之士早已看出了这一点,通过自筹资金或采用国际合作方式开展了前期研究工作,并取得了令人瞩目的研究进展,如利用转基因玉米生产植酸酶,在加工成动物饲料添加剂后,可有效降低家畜排泄物中的磷含量,这对于降低水污染和保护生态环境方面很有意义。



三、植物生物反应器的商业应用前景

在过去15年里,生物技术工业不仅诞生了百亿美元级的公司,而且也成为当今世界商业活动中增长最快的领域之一。生物技术产品的市场非常大,包括了医药、农业、渔业、造纸业和其他许多产业。据统计,从上世纪80年代至今,通过DNA重组技术所生产的生物医药年销售额已超过100亿美元。由于生物医药产业被许多国家视为强劲的经济增长点而加以重点扶持,生物医药的年销售规模将从1996年的101亿美元扩大到2006年的320亿美元,平均年增长率将达12%以上,其中治疗药物年平均增长16%,诊断试剂年平均增长9%。

美国是现代生物技术发展较早和较快的国家,1994年,美国生物技术药品年销售额为50多亿美元,至2001年,美国生物技术产品在全球市场上的销售额达200亿美元,占到全球总市场的约90%以上。此外,美国还拥有世界上约一半的生物技术公司和一半的生物技术专利。迄今为止,获得美国FDA批准上市的治疗类生物技术药品共16种,另外约有400多种生物诊断试剂在临床中应用。

欧共体国家是世界第二大医药市场,自身对生物技术产品的需求是巨大的,但它的生物医药研究滞后于美国,因此,欧共体国家正在加大对生物技术研究的投入,以提升其生物技术产业在国际市场上的地位和市场占有份额。进行同样努力的国家还包括***、加拿大和澳大利亚等一些发达国家。

我国现有500多家生物技术公司,但与西方发达国家相比,我国生物医药研究和产业化起步都比较晚。从1989年我国第一个生物工程药物β干扰素上市到2001年底,我国现有乙肝疫苗、促红细胞生成素(EPO)、人胰岛素、人生长素、细胞集落刺激因子(CSF)等15种基因工程药品投入市场。1997年,我国生物医药全年的产值达到125亿元,占整个医药工业的8.9%。

以EPO为例,它目前是世界上临床疗效最显著、销售额最可观的一种生物技术产品,销售利润多年来一直排在生物医药类产品的前三名,每年的增长率在10%以上。目前国内有十几家公司在生产EPO,年生产能力超过了500万支。由于受超额利润的诱惑,已有众多厂家介入这个市场,由于企业竞争过度,导致产品价格下降,利润摊薄。1999年1月11日,国家新药研究与开发协调小组在《生物医药工程产业行动纲要》中指出,国家和企业各方应大力培育生物医药工程产业,使之保持15-20%的年增长率,到2005年生物医药工业年总产值要达到400-500亿元,到2015年总产值达到1,100-1,300亿元。要达到此目标,需不断开发新的生物医药产品,另外,通过研制新的表达系统,增强表达效率和降低生产成本,对提高产品销售利润也非常重要。

目前,利用重组DNA技术生产的大多数治疗用血液蛋白几乎都是在哺乳动物细胞表达系统中生产出来的。该系统的主要优点是所表达的重组蛋白能够进行正确的折叠及完成其他翻译后加工过程的机会比较高,然而,有许多因素仍然限制哺乳动物细胞表达系统的广泛应用,这些因素包括:

1)即使在最适的培养条件下,重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平仍很低,通常为每天每升数十毫克;

2)重组蛋白最后必需从培养液中分离提纯出来,这会进一步导致产量损失和增加生产成本;

3)哺乳动物细胞表达系统日常维护费用非常高,这也使产品的生产成本居高不下;

4)哺乳动物细胞对外力比较敏感,而振荡培养通常又是工业化大规模生产所不可缺少的,这就使扩大生产规模变得相当困难;

5)胎牛血清是哺乳动物细胞生长所不可缺少的,它的价格昂贵,而且不同批次之间成份相差很大,这些变化会导致细胞的生长情况不一致,进而影响到细胞发酵过程及下游的提纯加工过程;

6)哺乳动物细胞对一些环境因素如温度、pH值、含氧量和次生代谢产物的变化非常的敏感,因此需要对培养条件进行精确的监控;

7)利用哺乳动物细胞培养表达系统不能避免病原生物的污染。

由于存在着上述限制因素,利用植物作为生物反应器生产具有临床应用价值的药用蛋白日益引起人们的关注。尤其是当重组蛋白需求量比较大,供给时间又是长期的话,利用植物表达系统很显然是一个不错的选择,它除了具备其它真核生物表达系统共有的那些优点外,还有一些是其它表达系统所不具备的。例如,利用植物所收获重组蛋白的数量仅仅受到植物种植面积的限制。普通的农业措施就可以产生令人吃惊的生物材料,例如,采用高密度种植的烟草每公顷可以产生170公吨的生物材料。假定在实验室规模所生产的重组蛋白水平在田间生产仍能够保持的话,那么170公吨的材料中有100公吨是叶子,每公顷土地就可以产生50公斤的分泌型抗体IgA或100公斤的重组葡萄糖脑苷脂酶(Glucocerebrosidase)。在表4-1中,列出了一些作物每公顷的生物产量作为重组蛋白生产量的依据。

亲合素(Avidin)在诊断试剂中的应用十分广泛,它是蛋清中比较丰富的一种真核生物蛋白,在常规情况下可从蛋清中直接分离纯化。在转基因玉米中生产这种蛋白并确定它是否能够与蛋清来源的鸡亲合素进行商业化竞争成为研究的理由。一个鸡亲合素蛋白的编码序列被首先按照玉米偏爱的密码子进行优化,然后与大麦α-淀粉酶信号肽编码序列融合并导入玉米染色体中表达。信号肽序列将决定重组蛋白定位在细胞的分泌系统内,而且对于成功表达十分关键,因为定位在分泌系统内的重组亲合素仅会导致玉米部分雄性不育或完全雄性不育,相反,如果亲合素在细胞质溶胶内积累的话,则因有毒性使基因工程玉米完全不能够成活。

每公斤转基因玉米种子可产230mg的亲合素,据估计这种玉米来源的亲合素成本约比蛋清来源的亲合素低10倍。玉米亲合素具有与天然蛋白相同的生物活性,现在成为商品公开出售(见Sigma-Aldrichproduct#A8706)。该研究结果表明:不仅是罕见的蛋白,即使在自然状态下相对丰富的蛋白也可以利用转基因植物以低廉的成本进行生产。利用转基因植物生产的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)也已经商品化,而利用植物生产重组蛋白酶抑制剂Aprotinin的成本也比牛肺来源的天然蛋白要低很多。考虑到重组抗体的天然生产来源不会像生产亲合素的蛋清一样低廉,因此利用转基因植物生产重组抗体所节省的资金将会更多。

人们对生物蛋白医药需求的种类和数量正在不断增加,研究人员必需开发出新的转基因表达生产系统才能满足这种需求,而植物最有希望承担此项任务,如上面所提到的那样,公斤数量的重组蛋白可以从1公顷的转基因烟草中获得。例如,人血清白蛋白全球每年的需求量是550吨,培育转基因动物产生足够量的蛋白满足市场需求需要数年时间,然而,转基因植物可以迅速达到如此生产规模。据估计要满足全世界的需求,一年种植3万公顷的烟草就足够了(假如血清白蛋白表达量占烟草可溶性蛋白的1%),而这一面积仅占到美国总种植面积3,200万公顷的千分之一。



四、未来20年植物生物反应器发展战略

1.农业、农村和农民现阶段面临的问题

改革开放20多年以来,我国农业和农业经济在总体上得到迅速发展,农村居民的收入水平也有了大幅度的提高。1978-2001年,扣除价格因素影响后农村居民人均收入由133元增加到2,352元,年均增加13%。与年收入增长相对应,我国农村居民的生活水平也不断提高,农村的贫困状况得到明显的减缓,贫困人口从1978年的2.5亿下降到2000年的3,000万,年均递减9%。在总体上,中国农村已经摆脱贫困,进入温饱有余的状态。部分地区已经达到小康水平,现在进入全面建设小康社会时期。“九五”以来,我国农业发展步入了一个新的发展时期,但我国农村经济的发展和农民收入的增长遇到了新的瓶颈。基本特征是:农业综合生产能力提高,农产品供求实现了总量平衡,且丰年有余。但由于农产品的需求受到制约,农产品总量的扩张已不能为农民创造更多的就业机会和收入来源,农业增产不增收或增产与增收严重不同步的矛盾比较突出。加入WTO后,我国农产品特别是种植业更是面临发达国家价格低、质量好的产品的激烈竞争,农民的处境更加艰难,因此高度重视农业收益和农民收入问题,千方百计增加农民收入是新时期我国农业和农村工作的重点,也是各级政府部门和农业科技工作者责无旁贷的任务。

近年来,种植业收入的大幅度下降主要不是农产品产量下降的结果。从单位面积的产量来看,除粮食作物在2000年减产外,其他主要作物均有不同程度的提高。以产量衡量的农业生产力在提高,但以收益衡量的生产率却在不断下降。农业这种低效益一方面与宏观经济环境有关,另一方面也与农产品品质不高、不适合市场要求有直接关系。以大豆为例,美国的转基因大豆在出油率和价格上均优于我国的非转基因大豆,所以国内食油加工业舍近求远,宁愿购买美国的转基因大豆,而不愿使用国产的非转基因大豆。

发达国家如美国、欧盟和***等对农民采用政府补贴的方式在我们国家行不通,要增加农民的收入,除了从农业外部做文章,全面免费免税,还必须想方设法增加农民的非农收入来源与渠道,更关键的是要对农业内部进行战略性的结构调整与改变,这才是改变农民地位和生活水平的根本之路。

2.应对措施

为提高农业经济效益和农民收入,增强农产品国际竞争力,应该大力推进农业和农村经济结构的战略性调整,特别是调整农产品的品种与品质结构,在确保粮食供应安全的前提下,将大路产品、低档产品、普通产品、原料性产品为主的生产转向增加优质产品、高档产品、专用产品、功能性产品和高经济附加值产品的生产。

实现上述目标的发展战略之一是国家应从宏观方面加强植物生物反应器的研究与产业化步伐,今后15-20年内,研究重点应该集中在以下几个方面:

1)发掘可供植物遗传转化或病毒载体表达的新药用蛋白基因,拥有我国自主知识产权。随着人们生活水平的提高,由于膳食不均衡带来的人类疾病如肥胖、高血脂、糖尿病和心血管疾病趋于大众化和年轻化,如果在植物中导入这些疾病的抑制蛋白基因,将来人们只需简单食用这些植物或由这些植物制成的新型功能性食品及药物,便可以获得抗病能力。种植这些高经济附加值的转基因作物可迅速带动农民致富,并由此形成新的产业链。以种植马铃薯为例,若每亩可产2,000公斤,每公斤马铃薯1.6元计算,农民每亩收入可达3,200元。若改种抗乙肝的转基因马铃薯,以每200克马铃薯可生产一剂乙肝口服疫苗,2,000公斤马铃薯可生产10,000剂乙肝口服疫苗。以每剂疫苗2元计算,则种植这样一亩马铃薯每亩可收入20,000元。

2)建立高效表达技术平台,提高外源蛋白在植物中的有效成份含量。这直接关系到将来的产业化进程,不仅可以降低生产成本,还可使植物表达系统更具吸引力。要做到这一点,可从两方面入手:一是筛选高效表达的植物启动子,二是选择蛋白含量比较高的植物如豆科植物等。最终目的是使外源蛋白的表达量达到植物总蛋白的1%-5%左右。

3)构建新的植物病毒表达载体系统,使其更易于操作、更稳定、表达效率更高和对生态环境更安全。利用基因工程植物病毒作载体,是生产多种药用蛋白的另外一条重要途径,也是最有希望实现产业化的研究领域之一。如利用病毒载体在植物中生产狂犬病毒疫苗、结核病菌抗原、丙型肝炎和SARS病毒疫苗,其有效性和安全性都将大大提高。

4)如果纯化步骤是必需的,那么如何降低从植物中提取药用蛋白和工农业用酶的生产成本则是首先要考虑的问题。如通过修饰外源蛋白基因,将其定位于植物不同的器官或部位中表达,或采用亲和层析的方法等。

6)除药用蛋白或酶制剂外,考虑利用植物生产其他具有特殊用途的高新生物制剂。如改性淀粉、脂类和其他次生代谢产物。

争取达到如下研究目标:

1)利用植物生物反应器技术生产轮状病毒多价口服疫苗、大肠杆菌(ETEC)和霍乱弧菌口服疫苗、口蹄疫、肺结核等5-10个医用蛋白或疫苗;预防和治疗心血管疾病的新型蛋白药物3-5种;高效表达降钙素、乳铁蛋白和降血压蛋白等3-5种具有保健功能的新型保健食品;工农业用酶5-10个;

2)获得8-10个外源基因表达效率高、组织或器官特异性强并有特殊工业、环保或农用价值的转基因植物株系或载体系统;

3)开展与植物生物反应器相关的新基因、新的生物元件和新技术、新方法研究,进入基因定点整合与植物生物反应器的产业化相配套的关键技术研究,为今后的长期发展奠定工作基础。取得发明专利20-30项,获得专利申请号50-100个;

4)建立3-5个大型的产业化基地并形成相应的产业集团。

我国在现阶段仍是一个发展中国家,不可能像发达国家一样投入巨资进行植物生物反应器的研究和开发,国家主要从政策上予以扶持和协调,特别是鼓励国内大中小企业积极参与,国家也要有重点地选择支持一些研究单位和课题,为此,我们提出如下建议:

1)增加不同学科,特别是医学界和植物分子生物学界科研工作者之间的学术交流,二者优势互补将有利于发掘新的研究课题,加快该领域的研究和研究成果的产业化步伐;

2)制订相应的优惠政策,鼓励企业投资参与研究和开发;

3)在科研经费投入上必须慎重,对开展工作比较好和已有工作基础的的研究单位和课题予以支持,切不能像过去一样一哄而上。投入必须注重回报,获得资助的单位和课题在结题时不能仅以论文和人才培养等借口搪塞,关键是要有直接的经济效益和社会效益。因为这是关系到将来千百万农民是否能够真正脱贫的大问题,因此以风险投资的形式为最好;

4)国家对课题的重视不能仅仅停留在研究阶段,更重要的是关注此后的产业化进程,要给予产业化过程以更大的资金和政策扶持;

5)广泛开展科普教育,提高全民文化素质,使百姓对基因工程及其产品有一个正确的认识。排除心理误区,做到既不一味排斥,也不盲目迷信。否则就会像欧洲国家那样,由于传媒的误导,使大众对所有的转基因产品产生了惧怕心理;

6)国家要在政策上予以强有力的支持,特别是理顺各部门的关系。不能因各部门的利益,而导致政令不通,影响我国研究成果的产业化进程,最终导致国外产品占据国内的绝大部分市场;

7)尽管植物来源的转基因产品,如药物蛋白被认为是最安全的(即具有公认的GRAS状态),但国家应及早制订相应的安全和管理法规,严格规范和监督这类基因工程产品的生产和使用。

专家简介:

刘德虎,男,博士,中国农科院生物技术研究所研究员。1962年12月16日出生。1991年毕业于北京农业大学植物保护系植物病理专业,并获得理学博士学位。同年6月分配到中国农业科学院生物技术研究所工作至今。现主要从事植物分子病毒学及抗病毒基因工程的研究,作为生物技术研究所和农业部重点实验室的青年科技骨干以及中国农业科学院跨世纪学科带头人,曾先后主持承担了国家“863”高新生物技术领域研究项目、国际青年科学基金和国家自然科学基金等8项研究课题。

http://www.caas.net.cn/bioinstitute_v1.0/List.asp?ArticleID=84

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我对此不是很清楚,我们在打疫苗时,那些疫苗不是没有活性的吗?那我这是植物蛋白制备多抗,蛋白有没有活性和制备抗体有关系吗,具体如何
超抗原研究进展123
者飘2003-10-26
综述
抗原与细胞耐受研究进展
正常人免疫系统在保持着对外来抗原反应性的同时,对自身组织特异性抗原呈不反应状态。在胸腺发育过程中的自反应性T细胞的生理排除是免疫系统建立自身耐受的主要机制⑴。但并非所有的抗原肽均在胸腺内,免疫耐受的产生尚有其他多种途径:包括克隆无能(anergy),克隆不识别⑵(ignorance),TCR表达降低⑶及其他一些如免疫细胞分化、免疫抑制的调控机制⑷等,成熟T细胞的耐受主要通过克隆无能。超抗原(superantigen,SAg)被用于体内外周T细胞耐受的模型中,对体内T细胞免疫反应的耐受的研究具有重要意义⑸⑹。本文将超抗原研究作一综述。
2概述
SAg是一群有二重功能的蛋白质分子,它们既能与MHC-II结构结合,又能激活表达适当的VTCR的T细胞(7)。与一般抗原相比,SAg有自己的特点:1.没有MHC-II特异性限制;2.SAg不必经过处理(3);3.SAg作用的位点与一般抗原位点不一样;4.最主要的特点就是激活细胞的比率数量和动力学过程不同(8)。在SAg的刺激下,T细胞出现选择性激活,引起细胞因子的快速产生和SAg反应细胞的快速扩增,在短暂的激活过去之后,SAg反应T细胞中一部分通过凋亡被排除,剩余一部分大约1/4的反应T细胞出现无能(6)。这一状态持续大约30-60天(9)。
SAg已在许多细菌、病毒、逆转录病毒、寄生虫甚至植物中发现。已确定的超抗原家族包括SES、TSST、SP、MAS和鼠的乳腺肿瘤逆转录病毒的一个开放阅读框架的产物(MLS决定簇)。金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxinsSES)是SAg的代表,研究的也最多。它是一类细菌蛋白,包括各种结构上相关的肠毒素:SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE。能几乎无MHC-II限制性地与MHC-II分子强力结合,从而与TCR在肽结合槽槽外结合。因为在小鼠只有25个V成分,而SAgSES能与4个不同的V相作用,因此,SAg反应T细胞占整个T细胞的5-35%,这较一般抗原肽与MHC形成的复合体要高出10000倍(10)-(13)。
SEB与SEC1、SEC3结构最相近;SEA和SEE在氨基酸水平有超过90%的相近。SEB与SEC1、SEB2、SEC3在氨基酸水平有70%相同,有着共同的三维折叠结构,这些高度同源的肠毒素具有促MHC-II结合和提呈、TCR识别、激活T细胞的功能区域。而某些特异性残基如ASN23、ASN60、Tyr61、Thr20、Tyr26与TCR的识别依赖于TCR的结构,相对不依赖于肠毒素氨基酸的确定序列(14)。
2超抗原的提呈与结合
小鼠APC上的MHC-II分子和人的HLA-II起到超抗原的结合位点的作用(15)。大部分的超抗原不需要APC的处理,有研究表明,经多聚甲醛处理过的APC与未处理的APC在提呈SEA和TSST-1中的作用是一样的,APC提呈的是完整的毒素而不是毒素的肽段。但也有少量超抗原如MAS需要APC的处理后提呈(16)(17)。超抗原的提呈需要APC上MHC-II,但却比MHC限制性反应要无序得多。APC的MHC等位基因不一定要与T细胞的等位基因相符,甚至异基因的MHC-II分子也足以起作用。SE通常在与MHC-II相联系之后以更大的亲和力与TCR相结合,MHC-SE-TCR三合体的形式使每一个双合体间的相互联系更加稳定。尽管有报道SAg如SEB可以直接刺激MHC-II-T细胞克隆和杂交瘤中的V3+T细胞亚群(3),但总的来说,MHC-II在与超抗原结合和随后T细胞的激活中起到非常重要的作用(18)。
SAg-MHC-II复合物大部分与V+TCR的T细胞结合,只有少部分与非V+TCR结合作用,如V9+的T细胞也对体外SEA起反应(17)。SEB特异性刺激人的V3+、V12+、V14+、V15+、V17+、V20+、T细胞亚群及小鼠的V8+T细胞亚群。MacDonal等研究发现SEB不但刺激V8+T细胞亚群,而且还刺激其它带有MHC-II的效应细胞包括T细胞和NK细胞(18)。
SE以APC依赖,而不是MHC-Ⅱ依赖的多种方式,通过肠毒素-TCR的相互作用来激活T细胞和调控效应分子的反应(14)。MHC-Ⅱ的作用是引导SAg-MHC-Ⅱ复合体上与TCR的最佳定位,SEB-HLA-DR1之间相对脆弱的联系则会因TCR与SEB的结合而变得稳固(19)。
3SAg刺激引起的细胞的变化
3.1T细胞增殖MiethkeT等在予小鼠注射SEB等SAg后的5分钟内SAg反应性T细胞就会发生细胞表面L选择素的丧失,在30分钟后这一现象结束,这是可检测到的第一个SAg反应T细胞的表型变化(20)。大约80%的SAg反应T细胞在接触SAg的48小时之内进入细胞周期的S期,进行有丝分裂、克隆扩增(21)。SEB刺激所引起的增殖反应动力学与剂量有关。但低剂量与高剂量的SEB所引起的最大增殖反应均发生在刺激后的第3天,且低剂量与高剂量即使相差100倍,其增殖反应的最大值也是相近的。经过快速而显著的增生,尽管随后发生失活,但SAg反应细胞的数量仍大量增加。外周T细胞迁移至脾,进一步增殖,随后凋亡、排除发生。脾脏既是SEB反应性T细胞的迁移地,也是SEB反应性V8+T细胞消除的位置(8)。
3.2SAg反应性T细胞的凋亡与排除对于SAg反应性T细胞的凋亡与增殖的先后顺序及因果关系仍有争议。体内高剂量SAg刺激24小时后即出现凋亡,其余的细胞则在3天后再次发生凋亡。这两个凋亡阶段中间隔以SEB反应细胞的克隆扩增。重复注射小剂量的SAg则可诱导出SAg反应性细胞的凋亡而无之前的增殖阶段(7)(22)(23)。BurkhardKneita等认为,在SAgSEB刺激后,成熟的T细胞在细胞周期的G1期不易发生凋亡,但在S期的T细胞则对凋亡敏感,所以高剂量的SAg或TCR配体激活T细胞后,生长因子(如IL-2)会促使T细胞进入细胞周期而引起凋亡(24)。增殖是SEB反应性T细胞凋亡的必要前奏,未增殖的细胞不会凋亡,即所谓的AICD(激活诱导的细胞死亡)(8)(23)(25)。
另外一些学者则认为SAgSEB反应性T细胞的增殖和克隆排除是两个独立的无关的反应。BurkhardKneita等认为小鼠在注射SAg后,Fas和Fas配体在SAg反应T细胞中的快速诱导说明Fas途径至少在SAg反应性T细胞的排除中起部分作用(23)、(26)。Stephen等加入外源IL-2或每日更换培养基并不能阻止细胞凋亡,提示凋亡的原因既不是重要营养素的缺乏,也不是毒性代谢产物的积聚(8)。
3.2SAg诱导的无能Rammersee等在用小淋巴细胞刺激因子SAgMLS-1作用于小鼠的实验中提出超抗原诱导的无能的概念,并为多个实验室所证实(26)(27)。“anergy”一词应指无反应,且也经常被人们这样理解。但对克隆anergy常指用特异抗原再次刺激细胞时,细胞增殖及产生IL-2的水平下降和/或对IL-2不反应(28)。anergyT细胞在二次反应仍分泌GM-CSF、IL-10、IFN-等细胞因子,并且这种anergy状态可被之后适当地重复接触Ag而逆转,如DNFB;外源性IL-2可诱导体内无能细胞的增殖;体内的强刺激也可恢复无能细胞的反应性(29);anergy还可在体外为抗CD28mAb、IL-2或表达B7、B70的转染物所逆转(30)。所以这种anergy实际是相对的,且是暂时的。
SAg反应T细胞的无能在SAg刺激后8-12小时发生,其持续时间与SAg的剂量成正相关(20)。初刺激的SAg的剂量越大,二次反应就越弱,anergy状态就越明显(8)。Yuh等报道SEB在体内刺激6小时无能产生(31)。Miethke等发现SEB体内刺激的小鼠在2-3小时之后即对再刺激无反应(20)。也有报道SEA刺激3d后二次刺激仍有SEA反应性T细胞的克隆增殖。这种结果上的差异可能与研究者运用不同SAg的剂量有关(7)。SAg剂量不同可引起不同的无能类型,低剂量SAg诱导T细胞弱反应而没有免疫抑制;高剂量SAg则诱导持久而不为APC、rIL-2、抗原等所逆转的无能抑制型(32)。但反复低剂量SAg刺激则与高剂量SAg刺激的最终结果是相近的(20)。SAg引起的反应性T的增殖与无能无关。增殖依赖于ICAM,无能的产生则无此依赖性(33)。
4SAg反应性T细胞发生无能的机制
4.1凋亡与无能最初研究者们认为激活诱导的细胞死亡或凋亡引起的大量SAg反应性T细胞中的高反应细胞亚群的排除是导致克隆反应增殖受抑的原因(7)、(22)、(34)。但目前大多数学者认为,反应性细胞对二次抗原的无反应是无能而不是由于排除,无能与增殖、凋亡的机制不同。
4.2APC的改变VivD等发现小鼠的免疫球蛋白链被裂解后,在B细胞缺如的情况下,用SAgSEB刺激会快速诱导出选择性V+T细胞的无能。因而推测专业APC的功能受抑或失活是SAg反应T细胞无能的原因(35)。NakamuraK等也认为SAg反应T细胞与非专业APC表面的SAg相互作用,因缺乏共刺激位置表现为亲和力低、反应弱而致无能(21)、(36)。OHehir和Lamb观察到SEB和SED在APCs-时可诱导人HA1.7T细胞的剂量依赖性增殖和无能(37)。
4.3TCR信号传导通路的改变
4.3.1TCR表达的快速下调LanzaVecchii认为在与抗原初次接触时,抗原特异性的TCR数量减少两倍,也不会对信号转导产生明显影响,但如果TCR发生内在化降解,则TCR显著下降,就会影响信号转导。反复抗原识别致使TCR内在化及子细胞不能合成足够的TCR以维持正常水平,致使TCR数量减少,导致TCR与SAg的亲和力下降(3)、(38)。
4.3.2共刺激信号的缺如及抑制分子的表达T细胞的激活至少需要两个信号:Ag/MHC与TCR结合产生的信号(信号1)和由APC通过T细胞上的表面分子提呈的共刺激信号(信号2)来促进激活,如CD28与APC上B7家族中的CD80、CD86相互作用;CD2-LFA-3、VLA-4、LAF-1及一定的细胞因子如IL-1、IL-6也能提供共刺激信号,但与CD28相比,效率较低,且不能阻碍无能的产生。因此CD28与CD80、CD86的缺乏将导致无能的产生。此外,T细胞表面存在的几个抑制T细胞激活的分子,如CTLA-4、V7分别与B7分子(CD80、CD86)、V7配体(如V7分子)结合作用,抑制SAg诱导的T细胞激活,也在无能的产生中起到重要作用(39)-(41)。
4.3.3IL-2R信号转导的障碍无能细胞IL-2R的高表达与不产生IL-2和/或对IL-2不反应。IL-2产生的缺乏是体外无能的重要标志。在加入外源性IL-2时可纠正体外无能细胞的无能状态,表现为增殖,而体内的无能细胞则不能利用IL-2,对IL-2不反应。在体外加入IL-2也只表现为部分逆转失活状态,说明IL-2R信号转导受到影响(42)。
高亲和力的IL-2R由、、链组成,中亲和力的IL-2R由、链组成,IL-2的生长信号主要由这两种IL-2R复合体转导。SusannaGrundstrom等认为链缺如导致的高亲和力受体的丧失,对激活与失活的功能改变作用不大(1)。、链在胞浆区域组成的异二聚体在信号转导调控生物反应中起到重要作用。链在胞浆区与JAK3相联,链的胞浆部分的Tyr338、Tyr392、Tyr510是STAT5的主要结合点。在IL-2结合后,IL-2链又与JAK1结合。这样、链异二聚体使JAK1、JAK3紧密相联,促其交联,并联接激活JAK/STAT通路。但也有人认为JAK1、JAK3功能互相独立,JAK1对JAK3的激活或IL-2刺激引发的细胞生长信号不是必需的。但有一点可以肯定,JAK3的激活在细胞进入有丝分裂的过程中起到重要的作用。SusannaGrundstrom等发现无能细胞对IL-7、IL-15不起反应,而后两者与链相结合发挥作用,说明细胞失活时,IL-2R链缺如受损。虽然JAK3、IL-2R链缺乏时尚能与IL-2R相联,但也可引致STAT5的酪氨酸磷酸化和激活受抑,信号转导减弱,AP-1、NF-K、NF-AT、NF-IL-2等转录分子表达下降(35)、(38)、(40)、(43)、(44)。
KiyoshiMigita等研究发现无能细胞对PMA和Ca2+的刺激能产生正常数量的IL-2,提示无能可能是由于靠近PKC的T细胞信号转导通路有缺陷造成,而远离PKC的通路则是完整的(43)。最近有报道体内失活T细胞中,TCR转导的JNK、ERK途径也受到干扰,这与c-Fos、FosB、JunB的表达减少有关(40)。有人认为JAK3、STAT5的激活也与c-Fos基因的诱导有关(45)。有研究表明IL-10可诱导SOCS(thesuppressorsofcytokine-signaling)的表达,后者是细胞因子信号转导的负调控的一个新家族(46)。这一家族在T细胞失活中的作用尚在进一步研究当中。
4.3.4处女T细胞与记忆T细胞的转化在SAgSEB的刺激作用下,TV表型分化为TM。记忆CD4+V8+T细胞表达CD45RB,缺乏在体外用SAg刺激后产生IL-2的能力。TM细胞共有的特性(包括非SEB引起的)是对再刺激不增殖,不分化淋巴细胞分子,不辅助B细胞(35)。TM细胞不能对SEB再刺激起反应,不是由于不能识别SAg,而是由于TM细胞没有或不完全的信号产生细胞失活。DominiqueSchols认为缺乏B7、B70表达的胸腺上皮细胞因缺乏共刺激信号,而将SAgSEB提呈给胸腺细胞时,或胸腺细胞在成熟阶段受到SEB刺激时而产生天然对SAg再刺激不反应的记忆细胞。未转化为TM的剩余的TV细胞则是对SAg体外再刺激尚存反应的原因(30)。
4.3.5环境因子的变化及对SAg反应细胞的影响Wang,Z.Q.及Pape等认为体外的局部环境中的抑制分子通过阻碍IL-2信号转导的方式来维持SAg诱导的T细胞的无能(47)-(49)。体内无能T细胞扩增的缺陷不能被同一淋巴结内其它T细胞提供的细胞因子所纠正,提示这种形式的耐受不易被打破(50)。
KarpusWJ发现SEB刺激后,Th1细胞诱导出SAg特异性的无反应,Th2细胞的反应却不受阻碍(但其在体外对SEB的再刺激却是失活的),提示SEB诱导CD4+T细胞的选择性变化,Th1细胞产生IL-2、IFN-、IL-12,Th2细胞则产生IL-4、IL-5、IL-10、IL-13(51)。有报道没有Th2细胞因子产生时SEB不能诱导T细胞的耐受(6),但SEB诱导的耐受并不是Th1细胞与Th2细胞的互相转换。DominiqueSchols认为无能细胞对SEB再刺激仍能产生大量GM-CSF、IFN-、IL-10,说明对IL-2、TNF-的产生途径是选择性关闭(30),O.Williams在重复注射SEA后也发现IL-2、TNF-水平的下降,无能细胞对刺激仍表达较高水平的IL-4mRNA(9),但却丧失对IL-4的反应能力。IL-1则有恢复其对IL-4反应的作用(52)。
有学者认为SES刺激T细胞产生的IL-10、TGF-和CD4-CD8-T细胞产生的IFN-参与维持T细胞的无能(50)。IFN-γ可加强诱导含氮氧化物合成酶的表达,导致含氮氧化物产生过量,从而阻碍T细胞增殖(53)、(54)。SAg刺激V转基因小鼠时,IL-10与二次刺激可能产生的IL-2成负相关,并对MHC-Ⅱ和共刺激信号的减少有间接作用(55)。TGF-有诱导口服耐受和眼前房的免疫屏障的作用,并可阻碍IL-2基因的表达和细胞周期的发展。
Kawahara认为凋亡小体也可以诱导T细胞无能(56)。另一些人认为无能T细胞可竞争APC和区域生长因子如IL-2或传递抑制信号给APC或附近的反应T细胞,还可通过抑制性细胞因子的分泌等各种方式来抑制细胞调控免疫系统(47)、(48)。
4.4CD8+T细胞与B细胞对SAg反应的影响有研究认为CD8+T细胞虽为MHC-Ⅰ限制性,但仍可识别MHC-ⅡSAg复合体(57),并在SAg诱导CD4+T细胞无能时,对SAg致敏的靶细胞如APC表现出溶解作用,因而与无能的产生有关(44)。但大多数研究者认为CD8+T细胞与SAg反应性T细胞的无能无关。SEB刺激后,CD8V+T细胞的数量一般回复到未刺激水平(8)、(34)。尽管SEB诱导的CD8+T细胞有调节细胞毒性的能力,也表现出体外对SEB再刺激产生IL-2的能力的下降,但体内再刺激时外周细胞克隆排除、体外再刺激时增殖受抑和IFN-产生受损却只存在于CD4+V+T细胞亚群内。CD8+效应细胞与CD4+V+T细胞在外周和胸腺排除中表现为低敏感性,与SAg反应性CD4+T细胞相比,CD8+T细胞仅是一个可检测到的“旁观者”的弱激活和分化(57)。因此SAg诱导的耐受可看作抗原诱导的外周CD4+T细胞的失活的变化情况(58)。
但CTL(即TcCD8+CD4-CD3+细胞)的反应对于保护非细胞的病毒感染却非常重要。HansAcha-Orbea等发现SAg如病毒MMTV可能产生一种机制逃避CTL的监控,因为与病毒的强烈扩增相比,CTL反应非常弱(58)。CD8+T细胞与提呈SAg的MHC-Ⅱ的亲和力低,抑制性细胞因子阻碍CTL激活及B细胞和T细胞耐受可能与此有关。
学者们认为SAgSEB选择性作用于CD4+T细胞,诱导Th1细胞无能,促使TV转化为TM,TM丧失了辅助B细胞的功能。但SAg不抑制Th2细胞亚群的反应,后者产生IL-2、IL-5、IL-10、IL-13促进体液免疫反应和IgG、IgA、IgE、表型的转变(6)、(9)。IgM的分泌在SEB刺激后既很快开始,并一直持续(55)。这也是SAg诱导的免疫反应的一个有趣的矛盾现象,T细胞免疫无能与体液免疫的激活并存。因此,可以说T细胞的无能的产生与B细胞无关,却影响B细胞的功能。
由上述可见,SAg可能利用多种方式、多种途径来激活T细胞和调控一个庞杂的效应分子反应。SAg调控作用可分为两个水平:细胞水平,T细胞的增殖、排除、无能;分子水平,信号传导通路改变及IL-10、TGF等细胞因子介导的抑制作用(44)。很有可能SAg诱导的免疫变化是各种机制及其他未明机制共同作用的结果。
5问题与展望
至今对SAg的免疫作用调控机制仍有许多不清楚和矛盾的地方(38)。有研究表明即使在共刺激存在时T细胞仍可产生无能。IL-2的产生受抑是否完全由T细胞的无能导致仍不清楚。研究者们加入外源性IL-2,只能部分逆转无能,而加入相当于被APC提呈的SEA刺激所产生的IL-2则反会加重无能的状态(41)。SEB初刺激后的小鼠的细胞对一般抗原和SAg均有减弱的反映,这使得TM无能的假说很难完全解释SEB诱导的无能,针对TCR信号传导通路而提出的诱导模式、选择模式和环境因子学说也存在这一问题(34)。SAg研究的复杂性还在于SAg的剂量、细胞培养条件不同(如体内、体外、新鲜细胞、培养细胞)等可产生不同甚至是相反的结果。
SAg的研究自80年代始至今方兴未艾。SAg的研究不但在免疫基础研究中而且在临床研究及应用中也有重要意义。它是许多感染性休克的病原,可引起大量炎症因子的释放导致器官组织功能受损和功能障碍,可帮助我们理解、阐明感染性休克的病生;它与众多人类自身免疫性疾病如川崎病、类风湿甚至ARDS有关(35);此外在器官移植的基础研究中SAg诱导的无能也日益受到重视:国内已有利用SAg引起的细胞毒性反应和TNF等肿瘤抑制分子的分泌来提高患者免疫力,杀伤肿瘤细胞(59)、(60)。
参考文献:
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Keyword:Cell-PenetratingPeptides,多肽修饰,分子动力学

关键词:抗原制备,电渗流,包涵体
出版时间:2015-10.ProteinExpressionandPurification118(2016)77-82.
特异性抗体是一个依赖性工具用于测定蛋白表达模式和测定蛋白在细胞内的位置。一般来说,重组抗体常作为抗原用于特异性抗体制备。然而,来源于哺乳动物和植物的重组蛋白常在大肠杆菌体内的包涵体中过表达。
因为溶解的抗原比较适合用于注射到动物体内产生抗原,所有这些包涵体的溶解是令人满意的。此外,高纯化的蛋白也被用来制备特异性抗体。为了获得纯化的蛋白(用来作为抗原),通过制备的圆盘凝胶电泳用于从包涵体中纯化蛋白。

纯化的蛋白含有0.1%SDS的电泳缓冲液(直接注射带免疫动物体内)中作为溶解的片段被回收,所以该方法适合用于从包涵体中纯化抗原。该方法也能用于制备大批量的抗原(几十毫升)。

Estimationofanti-AccDantibodiesusingwesternblotting.
采用蛋白免疫印迹估计抗AccD抗体

原文地址:http://www.ontoresinc.cn/Blog_%E5%88%B6%E5%A4%87%E7%9A%84%E5%9C%86%E7%9B%98%E5%87%9D%E8%83%B6%E7%94%B5%E6%B3%B3%E7%94%A8%E4%BA%8E%E4%BB%8E%E5%8C%85%E6%B6%B5%E4%BD%93%E4%B8%AD%E7%BA%AF%E5%8C%96%E6%8A%97%E5%8E%9F%E7%9A%84%E5%BA%94%E7%94%A8_82.html

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我采用原核表达的植物病毒衣壳蛋白,经SDS-PAGE切胶纯化的方法提取纯的蛋白(经电泳验证纯度)作为抗原,免疫家兔,制备出了较高效价的抗血清,该效价测定是用表达的提纯蛋白作抗原测定的,并且通过westernblot的方法验证可与感病植物中的病毒反应,但是有较弱的非特异反应,但是当我用血清来用dasELISA的方法来检测植物中的自然状态的病毒是,阴阳性对照的od值接近,用dotblot的方法得到几乎相同的结果,并且我是用三个人(我,师姐,我的一位老师)用同一种方法制备的血清,时间不同,并且我的那个老师是在中国农业大学一个国家重点实验室作的,因此我怀疑用这种策略制备抗血清本身是有缺陷的,以下是我的观点:
(1)原核表达的蛋白在空间构象上与在真核细胞是有区别的,缺乏一些特定的胞内折叠机制
(2)sds-page切胶回收的蛋白实际上是一个线形化的结构,缺乏正确的自然状态下的二三级结构,因此用它制备的血清所能结合的自然状态的病毒蛋白抗原决定簇有差异,最后表现在检测植物体内病毒时的非特异反应很强
(3)westernblot之所以能够检测是因为杂交到膜上的蛋白也是经过变性后成为线性化结构
不知道我这样说是不是有道理,我只是觉得如果三份这样的血清都出现这样的问题,应该不是检测方法操作的问题,而是血清本身有缺陷,虽然也有关于用这种方法制备血清并成功检测的报道.但是我想这与不同的病毒本身的性质有关.
望各位给予指点
日本血吸虫病的免疫学诊断主要包括循环抗体的检测、循环抗原的检测和循环免疫复合物的检测三个方面的内容,其中循环抗体的检测应用最为广泛。在循环抗体的检测诊断中,所用的抗原有卵抗原、虫体抗原等,而这些抗原多为粗制的虫卵与成虫抗原。血吸虫病免疫诊断方法的敏感性与特异性,除了与实验方法不同有关外,主要取决于所用诊断抗原的特性[1]。由于血吸虫生活史和组织学的复杂性,加之虫种发生过程表现的遗传差别,以及为适应环境变化而产生变异等多种原因,使得这些粗制的抗原十分复杂,易与其它病原体感染产生交叉反应[2],造成诊断结果难以标准化,检测这种抗体几乎没有疗效考核价值[3]。国内外研究证实,使用血吸虫特异性的、纯化的重组抗原,不仅可以提高血吸虫病诊断的敏感性和特异性,而且检测抗某些特异性抗原的短程抗体,具有一定的疗效考核价值[4,5,6]。因此,应用生物技术制备基因工程重组抗原,被越来越广泛地应用于血吸虫病的临床诊断,成为一个重要的研究内容[7]。目前,研究最多的有以下几种基因工程重组抗原。
一、重组抗原31/32kDa蛋白
Rupple等用曼氏血吸虫成虫抗原作免疫印迹诊断曼氏血吸虫病,发现所有血吸虫病患者血清均可识别31/32kDa蛋白(Sm31/31),而其他寄生虫病患者和正常人血清均不与Sm31/31反应,显示Sm31/32诊断曼氏血吸虫病具有很高的敏感性和特异性[8,9]。Rupple(1987)和石佑恩等[10]采用免疫印斑试验(immunoblot)证实日本血吸虫亦含有31/32kDa蛋白(Sj31/32)。纯化的Sm31/32和Sj31/32蛋白诊断血吸虫病具有较高的特异性和敏感性,且检测抗Sj31/32蛋白的特异性IgG1和IgG4具有疗效考核价值。Klinkert等[11]提取成虫mRNA,构建成虫CDNA文库,表达出以β-半乳糖苷酶融合蛋白形式的血吸虫蛋白,用斑点印迹法检测,发现融合蛋白诊断血吸虫病具有较高的敏感性和特异性。舒新华等[12]表达了重组日本血吸虫32kD抗原(rSj32),纯化的重组32kDa蛋白诊断日本血吸虫病具有很高的敏感性和特异性,可代替虫源性抗原(AWA和SEA)用于血吸虫病诊断。
二、重组抗原22.6kDa蛋白
张桂筠等对日本血吸虫中国大陆株(江西地理株)成虫cDNA库的免疫学筛选,获得了克隆化基因λSj514和表达克隆pGSj24[13]。核苷酸序列的同源性分析表明,pGSj24克隆所表达的重组蛋白确为日本血吸虫的蛋白成分,其基因与日本血吸虫22.6kDa蛋白基因同源性达95%,证明pGSj24表达蛋白为日本血吸虫22.6kDa蛋白[14]。rSj22.6kDa蛋白经免疫原性鉴定,该蛋白具有特异性[15]。
三、重组GST-DH融合蛋白
朱荫昌等根据Sm23的基因序列设计引物,成功地从日本血吸虫中国大陆株cDNA库中扩增出日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白基因片段,并获得了日本血吸虫中国大陆株Sj23含657bp的基因序列,经序列分析证实此基因片段的核苷酸序列与曼氏血吸虫23kDa膜蛋白基因序列有79.5的同源性,与日本血吸虫菲律宾株23kDa膜蛋白具有100的同源性[16],预示着此两分子具有相似的免疫学特性。余传信[3]等通过重组表达及亲和层析方法,制备了纯的重组日本血吸虫中国大陆株23kDa分子的大亲水肽段与GST的融合蛋白(GST2HD)分子,以此蛋白分子作为抗原对血吸虫病人血清、肝吸虫病人血清及健康人血清进行了ELISA检测,血吸虫病人阳性检出率为95.55%,与肝吸虫的交叉反应率为零,健康人无假阳性出现。而用SEA检测相同的血清样本,血吸虫病人的阳性检出率为93.33%,与肝吸虫的交叉反应率为3.44%,健康人的假阳性率为2.5%,重组GST2HD融合蛋白分子用于血吸虫病诊断的敏感性及特异性与SEA相似。分别用GST2HD融合蛋白和SEA分子对配对的治疗前与治疗后半年的同一病人血清进行检测,治疗后半年抗GST2HD特异性IgG的阴转率达到75.0%,表现为较高的阴转率,而治疗半年后抗SEA抗体的阴转率仅为12.5%,表明抗SjC23分子特异性抗体IgG是在治愈后阴转率较快的一种短程抗体,检测这种短程抗体具有较高的疗效考核价值。
四、重组抗原14-3-3蛋白
现已知14-3-3蛋白质是一组高度保守的多功能蛋白质,广泛分布于从植物到哺乳类动物等真核生物细胞内。14-3-3在动物体内主要存在于神经组织内,在神经细胞分化、系统发育和功能方面起着至关重要的作用[17]。汪学龙等[18]通过体外扩增和克隆了Sj14-3-3抗原编码区基因,并进行了序列测定。李德发等[19,20]体外扩增、克隆了日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3(Sj14-3-3)编码基因,成功地将Sj14-3-3基因定向克隆到高效原核表达质粒pET28a中,并将重组质粒转化到E.coliBL21中,37℃下经1mmol/LIPTG诱导,2h后sj14-3-3便以融合蛋白的形式得到高效表达。该蛋白的理论分子量为28.9kDa,加上融合蛋白约3.5kDa,表达蛋白的分子量约为32.4kDa。Westernblot结果显示,表达蛋白能被免疫血清特异性识别,说明融合蛋白中有14-3-3,且含有高度保守的氨基酸序列;表达蛋白能被重感染兔血清识别,进一步说明融合蛋白中的14-3-3具有天然14-3-3蛋白的免疫活性。研究发现,重组Sj14-3-3(rSj14-3-3)蛋白,具有血吸虫病诊断抗原的开发价值。
五、结语
基因重组技术生产的抗原具有成分单一、特异性和敏感性高、得量大且价廉等优点,为大量制备有效的诊断和免疫保护性抗原提供了新的途径。用基因工程的方法可以生产出性质与天然抗原分子相似的蛋白组分用于诊断和保护性免疫的研究。因此,利用基因重组技术提高蛋白表达量和纯度,大量生产重组抗原取代天然抗原用于诊断和疗效考核诊断,以降低查病费用是完全可能的[12]。血吸虫多种诊断抗原的基因已被克隆,并重组表达,有些重组抗原已初步应用于血吸虫病诊断。重组抗原诊断血吸虫病具有和天然抗原相似的敏感性和特异性,并且可区别病期和考核疗效。但是,目前多数重组抗原是在原核表达系统大肠杆菌中表达,由于原核表达系统不能对表达蛋白进行正确折叠和糖基化,因而表达的重组蛋白抗原性比天然抗原低,并且某些重组蛋白难以纯化,用于诊断血吸虫病时需用大肠杆菌提取物对血清样本进行预处理,这影响了重组抗原在血吸虫病疫区的推广应用。为解决上述问题,今后重组蛋白宜采用真核表达系统(如哺乳动物细胞)表达。总之,随着分子生物学和免疫学技术的进一步发展,更多的具有诊断价值的分子抗原(或表位)将被重组表达,并广泛应用于诊断血吸虫病。
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