请问:我用pet-32表达了我的目标蛋白,想用做抗原制备多克隆抗体。目标蛋白是以包含体的形式表达的融合蛋白,我用8M的尿素进行溶解后上Ni柱进行纯化,但整个过程中遇到了很多的问题,以前没有做过,还是菜鸟。请大家帮帮忙,在此先谢过!我遇到的问题有:
1、溶解效果不好:菌体加含8M的尿素的磷酸缓冲液后用超声波破菌,室温溶解1小时以上,甚至过夜溶解,溶解效果均很理想,虽然溶解了一部分,但是大多数还在沉淀里。我也做过含尿素梯度的缓冲液,我的目标蛋白在0.5M的尿素就有溶解,好像增加尿素的浓度对他的溶解影响不大一样,我想换用盐酸胍溶解,但是后面又要上柱子,不知道有没有影响,此外含盐酸胍的样品不能直接跑SDS-PAGE,所以很是郁闷。
2、Ni柱吸附样品不够好:将溶有我目标蛋白的样品上Ni柱进行纯化,但是上样前后的样品跑SDS-PAGE分析,没有多大的变化。纯化过程发现有很多的非特异性吸附。纯化后样品不够纯,大概只有50%。
3、纯度较高的浓度过低:由于要用于免疫,要求蛋白浓度要达到2mg/ml。但我的纯品很少,并且浓度过低,由于实验条件有限,浓缩样品又是一大难题。实验室没有冷冻干燥的装置,也不能用超滤,打算选用透析来浓缩,但是透析用的PEG会进入到样品中,这对免疫兔子影响是否会很大?会不会导致兔子死亡?有什么方法可以浓缩蛋白后将PEG去除?
4、此外是否可以用包含体的沉淀来免疫兔子?如果沉淀纯度够高的话
恳请高手们指教,盼回!谢谢!
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