[求助] 氯化铯纯化腺病毒
2006-11-23
问题描述：
各位xdjm，我在做腺病毒的纯化，用的是氯化铯密度梯度离心法，遇到了一些问题，急盼指点！不胜感激！
1、氯化铯的配制方法，如配制1.1g/ml、1.3g/ml和1.4g/ml的氯化铯应该是怎样配制呢？比例如何，是用tris－Hcl直接稀释呢，还是先配成饱和状态呢？
2、氯化铯纯化腺病毒以后，是用什么样的透析袋呢？一般孔径的可不可以啊？腺病毒的直径大约90nm。
再次谢过！！
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zehui_2005
用户
各位xdjm，我在做腺病毒的纯化，用的是氯化铯密度梯度离心法，遇到了一些问题，急盼指点！不胜感激！1、氯化铯的配制方法，如配制1.1g/ml、1.3g/ml和1.4g/ml的氯化铯应该是怎样配制呢？比例如何，是用tris－Hcl直接稀释呢，还是先配成饱和状态呢？2、氯化铯纯化腺病毒以后，是用什么样的透析袋呢？一般孔径的可不可以啊？腺病毒的直径大约90nm。再次谢过！！
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gexiaohu
用户展开引用hys我说的是扩增过程中收集培养基中的腺病毒，不是包装。我觉得收集腺病毒时的滴度跟你收集时机有关系，因为传统的收毒方式是只收集细胞的，倘若是等所有病毒都飘起来再收集，可能滴度会很低，因为部分细胞已经裂解，病毒都已经释放到培养基当中了。所以若只收集细胞，最好的收毒时机是等几乎所有细胞变圆，一半细胞飘起来是收集最好。而下面这篇文献提到的是用硫酸铵沉淀法收集培养基中的腺病毒，我反正是现在连培养基也一起收了。......收毒的时机很重要。一般来说不需要观察到细胞漂浮。收集病毒流程如下：1。转染骨架进入293。大约1个星期左右，收集上清，细胞分开收集，－80保存2。将上清感染另一板细胞；8小时收集上清（绝对不要超过12小时）。细胞分开收集，－80保存3。重复2步3次。此次上清病毒量已经是1步中的10倍以上了4。用此上清感染3板细胞，6－8小时收集上清5。用4步上清感染20板细胞，6小时收集细胞，－80保存，上清收集再感染20板细胞，同样收集细胞保存，此上清再感染20板细胞，直至80至100板细胞。6。将所有的细胞集中起来，裂解后就可以纯化了。无菌的问题不需要困扰，在重金属中什么细菌都生存不了。至于保存液也可以不用甘油，请搜索其他战友帖子。
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gexiaohu
用户楼上的你错了。氯化铯不原始！只要你技术到家，设备可靠，它获得的滴度与纯度远远好过你所谓的其他先进方法。（例如，滤膜结合法）用滤膜获得的病毒质量并不高，很多病毒碎片，影响滴度的计算。如果你有能力做氯化铯，我建议还是用氯化铯。做腺病毒不需要3个梯度。两个足以。现给楼主附上配方：CsCldiscontinuousgrADIentsCsCl1.4mg/ml53gCsCl+87ml10mMTris-HCl(PH7.9)CsCl1.2mg/ml26.8gCsCl+92ml10MTris-HCL(PH7.9)3.5ml1.2CsCL+3.5ml1.4CsCl+4mlSample(11ml)100000g(35000rpm)2~3h4~10decleration=0Viralstockbuffer:20mMTris-HClPH8.025mMNaCl2.5%Glycerol保证可用，呵呵！！
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zehui_2005
用户后面一个问题解决了，文献上说腺病毒的分子量很大，因为一般是4万个bp，所以一般的透析袋都不会漏出去，应用3000道尔顿到25000道尔顿的透析袋都可以，第一个问题尚待解决，多谢啦！
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dongxy
用户展开引用zehui_2005各位xdjm，我在做腺病毒的纯化，用的是氯化铯密度梯度离心法，遇到了一些问题，急盼指点！不胜感激！1、氯化铯的配制方法，如配制1.1g/ml、1.3g/ml和1.4g/ml的氯化铯应该是怎样配制呢？比例如何，是用tris－Hcl直接稀释呢，还是先配成饱和状态呢？2、氯化铯纯化腺病毒以后，是用什么样的透析袋呢？一般孔径的可不可以啊？腺病毒的直径大约90nm。再次谢过！！......为什么用氯化铯法呢？太原始了。
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gexiaohu
用户楼上的你错了。氯化铯不原始！只要你技术到家，设备可靠，它获得的滴度与纯度远远好过你所谓的其他先进方法。（例如，滤膜结合法）用滤膜获得的病毒质量并不高，很多病毒碎片，影响滴度的计算。如果你有能力做氯化铯，我建议还是用氯化铯。做腺病毒不需要3个梯度。两个足以。现给楼主附上配方：CsCldiscontinuousgrADIentsCsCl1.4mg/ml53gCsCl+87ml10mMTris-HCl(PH7.9)CsCl1.2mg/ml26.8gCsCl+92ml10MTris-HCL(PH7.9)3.5ml1.2CsCL+3.5ml1.4CsCl+4mlSample(11ml)100000g(35000rpm)2~3h4~10decleration=0Viralstockbuffer:20mMTris-HClPH8.025mMNaCl2.5%Glycerol保证可用，呵呵！！
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Liubyrj
用户腺病毒CsCl纯化用1.2和1.4，配CsCl时要测比重的，如果没有仪器，最简单的办法，用eppendroftube装1mlH2O,使其正好是1g,然后调整你的溶液分别和水一样体积的是1.2和1.4。第一次72000xg2hr把中间白色的band(腺病毒）取出来，要再离心一次72000xgON,。透析用分子量100000的，透析液：tris4.84g,Mgcl21.62g,sucrose200g4L,4hr一次，2次。
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hys
用户展开引用gexiaohu楼上的你错了。氯化铯不原始！只要你技术到家，设备可靠，它获得的滴度与纯度远远好过你所谓的其他先进方法。（例如，滤膜结合法）用滤膜获得的病毒质量并不高，很多病毒碎片，影响滴度的计算。如果你有能力做氯化铯，我建议还是用氯化铯。做腺病毒不需要3个梯度。两个足以。现给楼主附上配方：CsCldiscontinuousgrADIentsCsCl1.4mg/ml53gCsCl+87ml10mMTris-HCl(PH7.9)CsCl1.2mg/ml26.8gCsCl+92ml10MTris-HCL(PH7.9)3.5ml1.2CsCL+3.5ml1.4CsCl+4mlSample(11ml)100000g(35000rpm)2~3h4~10decleration=0Viralstockbuffer:20mMTris-HClPH8.025mMNaCl2.5%Glycerol保证可用，呵呵！！......想请教gexiaohu几个问题：1。打动物时是不是不能加甘油，因为它比较粘稠，会增加注射的难度2。离心管顶层是不是还要加什么矿物油呢
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zehui_2005
用户呵呵，谢谢gexiaohu战友的热心帮助，我现在已经做完了氯化铯离心，电镜观察得到的病毒还可以，滴度也在10的11次方左右，感觉不连续的梯度离心法效果还是不错的。有其他的方法固然好，但是经费有限，还是用最经济实用的吧。
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wilson
用户我问过发明腺病毒表达载体得专家HeT.C.他们也是通过CsCl梯度离心得办法纯化DNA，所以这个方法还说不上原始
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llqlyqfly
用户各位专家,请指教:如何感染293细胞扩增病毒,为何加10%甘油保存病毒,甘油用何液体配制;另外有无这方面书或文章请推荐一下,非常感谢!
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hys
用户zehui_2005呵呵，谢谢gexiaohu战友的热心帮助，我现在已经做完了氯化铯离心，电镜观察得到的病毒还可以，滴度也在10的11次方左右，感觉不连续的梯度离心法效果还是不错的。有其他的方法固然好，但是经费有限，还是用最经济实用的吧。想请教zehui_2005战友几个小问题：1.你扩增了多少盘细胞（大概是150mm直径的那种）纯化后滴度才能得到10的11次方呢？2.还有像你们扩增病毒时是要等细胞完全飘起来收集呢，还是飘起来一半时就收集的呢？3.还有就是你们收病毒时，培养基里的病毒也收吗，因为我看有的文献是说培养基中含有20%~80%的腺病毒，可以用饱和度40%的硫酸铵沉淀收集。
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medicalet
用户请教hys战友,收集培养基中腺病毒的PROTOCOL在哪篇文章中,我想看看,我也在做腺病毒包装,病毒滴度很低,不知怎么办才好.
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hys
用户我说的是扩增过程中收集培养基中的腺病毒，不是包装。我觉得收集腺病毒时的滴度跟你收集时机有关系，因为传统的收毒方式是只收集细胞的，倘若是等所有病毒都飘起来再收集，可能滴度会很低，因为部分细胞已经裂解，病毒都已经释放到培养基当中了。所以若只收集细胞，最好的收毒时机是等几乎所有细胞变圆，一半细胞飘起来是收集最好。而下面这篇文献提到的是用硫酸铵沉淀法收集培养基中的腺病毒，我反正是现在连培养基也一起收了。easymethodtoincreasethetotalvirusyield.pdf(175.58k)
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zehui_2005
用户想请教zehui_2005战友几个小问题：1.你扩增了多少盘细胞（大概是150mm直径的那种）纯化后滴度才能得到10的11次方呢？2.还有像你们扩增病毒时是要等细胞完全飘起来收集呢，还是飘起来一半时就收集的呢？3.还有就是你们收病毒时，培养基里的病毒也收吗，因为我看有的文献是说培养基中含有20%~80%的腺病毒，可以用饱和度40%的硫酸铵沉淀收集。hys，你好！1、我扩增了10瓶75cm2的瓶子才收集了10的11次方的滴度，但是氯化铯梯度离心我没有经验，所以可能还丢了一部分，否则滴度会更高。2、一般都是飘起来一半就收集。3、我没有收培养基里的病毒，都是收的细胞中的病毒。没有用过你说的沉淀法。
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hys
用户才十瓶75CM2纯化后就有10的11次方啊，挺高的。因为我以前看文献报道说是氯化铯超离会损失60%~70%的。
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erguo918
用户我的经验是收集50瓶75cm2的瓶子，并做氯化铯梯度离心总滴度可以达到10的12次方PFU。VP/PFU的比值在10%-30%之间。这是用我们的系统得到的结果，Adeasy系统也可以达到不错的滴度。
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hys
用户erguo918我的经验是收集50瓶75cm2的瓶子，并做氯化铯梯度离心总滴度可以达到10的12次方PFU。VP/PFU的比值在10%-30%之间。这是用我们的系统得到的结果，Adeasy系统也可以达到不错的滴度。好羡慕啊，真希望我纯化后也有这样的滴度:P
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hys
用户在请教诸位几个小问题：1.1.2g/ml和1.4g/ml这两个梯度你们通常是怎么加的呢，是先加1.2g/ml,然后再把吸管伸到底部加1.4g/ml，还是直接在1.4g/ml的表面加上1.2g/ml的梯度呢？2.这两个梯度之间是不是会有明显的界面呢？3.最后加在最上面的那个样本还需不需要调整密度呀，我看有的地方是直接将重悬的细胞反复冻融后离心取上清加在表面，还有的是把上清加了CsCl离心15分钟说是进一步去除细胞残杂，然后再纯化的，不知这一步有无必要？4.最顶上还需要加什么矿物油吗？
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nerium63
用户我的经验是最后收到多少滴度的病毒不仅和扩增的细胞盘数有关系，和病毒所带基因也有关系，如果带的是如TRAIL等基因，最后同样盘数的病毒滴度会相对于空载体降低一到二个数量级。第二个问题，一般我们做的时候是配完1.1g/ml、和1.4g/ml的氯化铯后用培养皿和抢称好调整好，然后先1.4g/ml，然后1.3g/ml，最后加上1.g/ml带病毒的氯化铯，一滴一滴慢慢加，分层还是比较明显的。
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nerium63
用户最后样品加入1.1g/ml后可以用12000RPM离心一下，然后用上清做超离就可以。
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medicalet
用户谢谢hys战友！已阅读了这篇文献,有一点疑问,硫酸铵加入培养液上清时文献说是以粉末直接加入(1L中加242.3g至40%终浓度),那么如何才能保证无菌呢,希望有经验的朋友予以解答,谢谢了!
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hys
用户我想是无法保证无菌的，反正要经过氯化铯纯化，更何况氯化铯纯化本身也不是无菌的。
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zehui_2005
用户应该没有办法保证无菌，纯化完以后可以用0.22um的滤器过滤一下。
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gexiaohu
用户展开引用hys我说的是扩增过程中收集培养基中的腺病毒，不是包装。我觉得收集腺病毒时的滴度跟你收集时机有关系，因为传统的收毒方式是只收集细胞的，倘若是等所有病毒都飘起来再收集，可能滴度会很低，因为部分细胞已经裂解，病毒都已经释放到培养基当中了。所以若只收集细胞，最好的收毒时机是等几乎所有细胞变圆，一半细胞飘起来是收集最好。而下面这篇文献提到的是用硫酸铵沉淀法收集培养基中的腺病毒，我反正是现在连培养基也一起收了。......收毒的时机很重要。一般来说不需要观察到细胞漂浮。收集病毒流程如下：1。转染骨架进入293。大约1个星期左右，收集上清，细胞分开收集，－80保存2。将上清感染另一板细胞；8小时收集上清（绝对不要超过12小时）。细胞分开收集，－80保存3。重复2步3次。此次上清病毒量已经是1步中的10倍以上了4。用此上清感染3板细胞，6－8小时收集上清5。用4步上清感染20板细胞，6小时收集细胞，－80保存，上清收集再感染20板细胞，同样收集细胞保存，此上清再感染20板细胞，直至80至100板细胞。6。将所有的细胞集中起来，裂解后就可以纯化了。无菌的问题不需要困扰，在重金属中什么细菌都生存不了。至于保存液也可以不用甘油，请搜索其他战友帖子。
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hys
用户楼上的方法还真是头一次听说，6小时就可以收集病毒？不知这样纯化后病毒的产量与传统的方法相比如何？
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gexiaohu
用户超过8小时，或者你等细胞浮起来的时候，其实已经意味着病毒释放到上清里了。6至8小时收病毒，就是为了最大限度保留病毒，仅仅利用上清中的残留病毒去感染下一批细胞。至于与所谓“传统”的方法没有比较过，但是我可以给你一个指标，如果最后冻融法裂解细胞后，你的上清液是呈绿色的话，这表明病毒滴度很高。绿色越深，滴度越高。你可以自己回忆一下，你的裂解液上清是什么颜色。
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hys
用户可是不是说病毒的复制周期都有20几个小时吗，8个小时病毒恐怕还没有充分增值以及包装完全吧。我觉得上清裂解液的颜色一般都跟你重悬所用的溶液有关，因为有时是用培养基5%DMEM重悬的，所以是红色的，如果是tris的话好像就是偏黄色，可是还真是没有注意过会呈绿色的，不知做过腺病毒的同道们能否回忆一下你们平时细胞冻融以后一般是什么颜色。
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medicalet
用户有一种方法，是我听外地实验室师弟告诉我的，他们实验室都是在用腺病毒感染293细胞48小时内，用吸管吹打使细胞脱壁，接下来不离心，直接将全部培养液及细胞－80/37冻融3次后，离心取1/10上清感染下一批293细胞，剩余上清分管－80保存，据说效果不错，一般到扩增第3代后18小时左右就有约1/3漂浮了。
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hys
用户我现在干脆直接细胞归细胞，上清归上清，细胞收起来纯化用，然后再将上清转染下一代293
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gexiaohu
用户hys我现在干脆直接细胞归细胞，上清归上清，细胞收起来纯化用，然后再将上清转染下一代293我就是这个意思。呵呵！
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hys
用户再请教诸位一个问题，就是透析时非要在透析液中加搅拌器吗，我们实验室的搅拌器坏了，所以我只好就把透析袋放过夜了。结果发现透析第二天所测滴度跟头一天相比有所降低，不知是不是病毒在4度时间不能放置过长的缘故。
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lanyang
用户看来各位的实验室条件比较好啊，我就很倒霉了，实验条件差啊，没有超速离心机啊。早也问过本元正阳的技术人员，氯化铯法是最好的方法啊。无赖我们没有超速离心机，只好去买试剂盒纯化了，Clontech公司有一种就非常好不过价格也贵，后来又发现一个更便宜的500RMB10次纯化，一次可收5-10个T75cm的细胞，不过还没试过，效果不错的话就推荐给大家。我收完病毒反复裂解后离心上清是浅绿色的，我觉得这个是和大家用的什么系统有关，Ad-Easy的带绿色荧光蛋白就可以看到这种现象，而且代数越高越明显。不过我也问过一为香港中文大学的师兄，要是做细胞的话也可以不用纯化的，直接用裂解后的上清做就可以了，当然要上动物的话肯定要纯化的，溶解可以不要甘油的，可以用葡萄糖的
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Devan
用户请问lanyang：你用的腺病毒纯化试剂盒是那个公司的？你纯化的效果如何？
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harbinger3
用户大家可以看看何通川他们今年发表在NatureProtocols上面的一篇文章，详细介绍了利用pAdEasy系统进行腺病毒的制备，非常详细。有关纯化，TC他们首先还是推荐CsCl的。
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erguo918
用户同意harbinger3的观点。密度梯度离心是最好的纯化腺病毒的办法。离子交换，色谱等纯化方法得到的腺病毒，往往有活性的病毒比例非常低，这是因为腺病毒在包装的过程中会包装一些基因组不完整的病毒，甚至是空壳病毒。这样按照分子量大小不同或者密度不同的方法来分离腺病毒颗粒能得到更多有活性的病毒颗粒。
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kennyzzx
用户展开引用zehui_2005想请教zehui_2005战友几个小问题：1.你扩增了多少盘细胞（大概是150mm直径的那种）纯化后滴度才能得到10的11次方呢？2.还有像你们扩增病毒时是要等细胞完全飘起来收集呢，还是飘起来一半时就收集的呢？3.还有就是你们收病毒时，培养基里的病毒也收吗，因为我看有的文献是说培养基中含有20%~80%的腺病毒，可以用饱和度40%的硫酸铵沉淀收集。hys，你好！1、我扩增了10瓶75cm2的瓶子才收集了10的11次方的滴度，但是氯化铯梯度离心我没有经验，所以可能还丢了一部分，否则滴度会更高。2、一般都是飘起来一半就收集。3、我没有收培养基里的病毒，都是收的细胞中的病毒。没有用过你说的沉淀法。......想请教zehui_2005战友几个小问题：1、用293细胞扩增重组腺病毒大概要多少瓶细胞？2、293细胞传代和复苏时总有一部分细胞漂浮，是什么原因啊？3、我离心细胞用的是1800rpm,10min，是不是和这个有关呢？
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