透析得可溶的重折叠σ32 单体实验
试剂、试剂盒 | TrisNaCl 仪器、耗材 | CentriconTM-10型离心浓缩器大小排阻髙效液相色谱柱 实验步骤 | 材料与设备 CentriconTM-10型离心浓缩器(Amicon,Inc.) 大小排阻髙效液相色谱柱TSK-GELG3000PWXL(7.8x300mm)(Tosohaas) 50mmol/LTris(pH7.9)+200mmol/LNaCl 操作程序 用大小排阻HPLC色谱检测可溶性单体的形成 1)在拟试的条件下透析样品。 2)从透析袋中取出样品,13000r/min离心10min,使澄清。保留上清。 3)若透析时样品的蛋白浓度太低,则可用Cenricon-10型离心浓缩器浓缩。于Centricon-10管中加2.0ml透析样品,13000r/min离心90min,或至体积减至原体积的1/5~1/10。 注:需要选择某一孔径大小的Centricon管,以使水和盐能在离心力作用下透过膜而把σ32保留下来。Centricon-30和Centrioon-100管的孔径较大,浓缩也较快,但本实验采用Centricon-10管,其标称截留分子量为10000Da,这是因为σ32的分子量是32000Da而有些σ32会通过较大的孔透出。Centricon管也可用来改变样品的盐浓度。可简单地将样品浓缩10倍,再用另一种缓冲液将其恢复至原体积。能处理更小(0.5ml;Micrecon型)和更大(20ml;Centriprep型)体积的浓缩器也均可从Amicon公司买到。 4)给大小排阻色谱柱TSK-GELG3000PWXL(7.8x300mm)进样100~400ul上清,该柱事先用50mmol/LTris(pH7.9)+200mmol/LNaCl在1ml/min流速下平衡,并在相同条件下洗脱,分部收集0.5-ml组分,计30min。 注:加盐是为了防止蛋白质与聚合物基质的弱离子结合,这种结合作用会使洗脱时间失真,妨碍大小排阻色谱分析正常进行。 5)用紫外检測器于280mn检测柱的流出液,估算作为可溶性单体而流出的物料的比例。 注:应先标定HPIX的大小排阻色谱柱,方法是用一组已知分子量的蛋白质在相同洗脱条件下过柱分析。再以分子量标准参照物的出峰时间对其分子量的对数作图,用插入法即可求出分析σ32透析样品时所洗联的那种蛋白质的分子量。 6)如必要,用SDS-PAGE电泳分析所选的组分,以证实洗脱峰的一致性。 |
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发布于 : 2018-08-10
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