材料

缓冲液和溶液

贮存液、缓冲液和试剂的成分请参见附录1。
贮存液稀释至适当浓度。

细胞裂解缓冲液I
50mmol/LTris-Cl(pH8.0)
1mmol/LEDTA(pH8.0)
100mmol/LNaCl

细胞裂解缓冲液Ⅱ,冰冷
50mmol/LTris-Cl(pH8.0)
10mmol/LEDTA(pH8.0)
100mmol/LNaCl
0.5%TritonX-100

脱氧胆酸
使用蛋白级的胆酸/去污剂。

HCl(12mol/L)(浓盐酸）

包涵体溶解缓冲液I
50mmol/LTris-Cl(pH8.0)
1mmol/LEDTA(pH8.0)
100mmol/LNaCl
8mol/L尿素
0.1mol/LPMSF
缓冲液现用现配。

包涵体溶解缓冲液Ⅱ
50mmol/LKH₂PO₄(pH10.7)
1mmol/LEDTA(pH8.0)
50mmol/LNaCl

KOH(10mol/L)

PMSF(100mmol/L)

1x和2XSDS凝胶加样缓冲液
不含DTT的1x和2xSDS凝胶加样缓冲液室溫保存，lmol/LDTT贮存液现用现加于上述缓冲液。

含尿素的Tris-Cl(0.1mol/L,pH8.5)
仅限于方法2使用，请见步骤7。配制内含尿素浓度递增（如0.5、1、2和5mol/L)的0.1mol/LTris-Cl(PH8.5)。使用前用固体尿素现用现配，不能使用任何尿素贮存液，因为尿素容易分解。

酶和缓冲液

DNaseI(1mg/ml)

溶菌酶（10mg/ml)
用Tris-Cl(PH8.0)现用现配。

凝胶

SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备请参考附录8。

离心机和转头

SorvallGSA转头或相当的转头

特别配备

pH试纸
备用，请见步骤10。

磨光玻璃棒

载体和细菌菌株

表达靶蛋白的大肠杆菌细胞
培养1L以包涵体形式表达靶蛋白的大肠杆菌细胞

方法

制备细胞抽提物

1.1L表达细胞培养物于预先称重的离心管中4°C以5000g(5500r/minSorvallGSA转头）离心15min。
注意：步骤2~4—定要在4°C进行。

2.吸去上清，称菌体沉淀的重量，每克（湿重）菌体加入3ml细胞裂解缓冲液I，轻轻旋动或用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。

3.每克（湿重）菌体加入4ul100mmol/LPMSF,80ul10mg/ml溶菌酶，搅动20min也可以加入其他蛋白酶抑制剂混和物（见方案1)。

4.每克（湿重）菌体加入4mg脱氧胆酸，继续搅动。

5.悬液37°C放置，不时用磨光玻璃棒搅动，待其变黏时每克（湿重）菌体加入20ul1mg/mlDNaseI。

6.裂解液室温放置，直至不再黏稠（约30min)。

纯化和洗涤包涵体

7.用下述两种方法之一纯化和洗涤包涵体。

方法1:用TritonX-100提取包涵体

下述流程是对Marston等（1984)所用方法的改进。

a.细胞裂解物4°C高速离心15min。

b.倾倒去除上清，沉淀重悬于9倍体积的4°C细胞裂解缓冲液Ⅱ。

c.悬液室温放置5min。

d.高速离心15min。

e.倾倒上清，留置待用。沉淀重悬于100ul水。

f.各取10ul上清和沉淀，分别与10ul2XSDS凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析靶蛋白的分布。

g.必要时继续步骤8溶解包涵体。

方法2:用尿素提取包涵体

下面的程序是用含有不同浓度尿素的缓冲液洗涤和溶解包涵体，摘自Schoner等(1985)。

a.细胞裂解物4°C高速离心15min。
注意：步骤b、d和f必须在4°C进行。

b.倾倒去除上清，每克（湿重）菌体沉淀重悬于1ml水中。每支100ul装4支离心管，其余4°C保存。

c.4°C高速离心15min。

d.毎份沉淀重悬于100ul含不同浓度（如0.5、1、2和5mol/L)尿素的0.1mol/LTris-Cl(pH8.5)。

e.4°C高速离心15min。

f.倾倒上清，留置待用，每份菌体沉淀重悬于100ul水中。

g，各取10ul上清和沉淀，分别与10ul2XSDS凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析哪个浓度的尿素洗涤效果最佳。

h.用步骤g确定的最佳浓度，按上述方案洗涤剩余包涵体沉淀（步骤b)。

i.必要时继续步骤8溶解包涵体。

溶解包涵体

8.取适量步骤7的重悬细胞沉淀，4°C高速离心15min,沉淀重悬于100ul含0.1mmol/LPMSF(现用现加）的包涵体溶解缓冲液I。

9.室温放置lh。

10.把溶液加入到9倍体积的包涵体溶解缓冲液II中，室温放置30min。检査pH是否维持在10.7,必要时用10mol/LKOH调节。

11.用12mol/L盐酸将溶液pH调至8.0,室温放置至少30min。

12.室温高速离心15min。

13.倾倒上清，留置待用，沉淀重悬于100ul1XSDS凝胶加样缓冲液。

14.取10ul上清与10ul2xSDS凝胶加样缓冲液混和，上清和沉淀分别进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析溶解程度，继续附加方案。