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Northern杂交
来自 : 蚂蚁淘
实验方法原理转移并固定到膜上的RNA样品可以与特异的探针杂交,从而用来对所感兴趣的RNA进行定位。视实验人员和条件的差异,可以从多种方法中选择任意一种来标记和检测探针。用抑制非特异吸收探针的封闭试剂处理膜之后,在适于探针和固定的靶RNA杂交的条件下将膜同探针孵育,而后广泛洗膜以去除非特异结合的探针,最终在膜上产生一个紧密结合探针的影像分布。分析了杂交结果之后,探针可以从膜上洗去,膜可重复使用于下一个实验。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、材料

1.缓冲液和溶液

预杂交液(0.5mol/LpH7.2),7%(m/V)SDS,1mmol/LEDTA(pH7.0))

SSC(0.5X,1X,和2X)含0.1%(m/V)SDS

SSC(0.1X和0.5X)含0.1%(m/V)SDS

2.核酸和寡核苷酸

DNA或RNA探针(>2X108cpm/μg)

固定于膜上的RNA

3.专用设备

滤纸(Whamian3MM或相当效果的滤纸)

沸水浴

预热到68℃的水浴

预设到杂交温度的水浴

二、方法

1.在10~20ml预杂交液中68℃温育膜2h。

2.若使用双链探针,在100℃下加热32P标记的双链DNA5min,使之变性,然后迅速移至冰水中冷却。

3.把变性的或单链放射性标记的探针直接加到预杂交液中,在合适的温度下继续温育12~16h。

4.杂交后,将膜从塑料袋中取出,在室温下迅速转移到含有100~200ml1XSSC,0.1%SDS的塑料盒内,将盒盖好,置于水平振荡器上,温和振荡10min。

5.将膜转移至另一含有100~200ml预热至68℃、含0.1%SDS的0.5XSSC的塑料盒中。68℃下温和振荡10min。

6.重复步骤5,再洗涤至少2次,使68℃下共洗涤3次。

7.在印迹纸上晾干膜,然后让膜于-70℃下在含增感屏的暗盒内对X线片(KodakXAR-5或相应的胶片)放射自显影24~48h。此外,也可通过磷图像系统扫描得到膜上的图像。

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