CRISPR文库构建时涂板菌总是长得太少怎么办？

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2017-03-10

问题描述：

我用PCR扩增sgRNA文库oligo片段，胶回收，浓度约16ng/ul。载体用BsmBI酶切，55度过夜，胶回收，浓度19ng/ul。然后用T4连接酶22度连接1小时，电转2ul连接产物至感受态细胞，37度摇1小时，然后涂15cmLB板过夜。正常应该长至少一万克隆，可是我的板只有一两千。怎么办？挑了几个克隆做一代测序测不出信号。

我用感受态附带的质粒做了质控，可以长七八千克隆，说明感受态和电转程序都没有问题。用过NEB的Gibson连接酶，长的克隆反而更少。

做了两个多月一直是这样，急求帮助啊！能帮忙找到问题的可以有额外红包奖励~~谢谢了！

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霓___

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你好！问题解决了吗？遇到类似问题...

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david_xmu

用户

展开引用lavender_ting我用PCR扩增sgRNA文库oligo片段，胶回收，浓度约16ng/ul。载体用BsmBI酶切，55度过夜，胶回收，浓度19ng/ul。然后用T4连接酶22度连接1小时，电转2ul连接产物至感受态细胞，37度摇1小时，然后涂15cmLB板过夜。正常应该长至少一万克隆，可是我的板只有一两千。怎么办？挑了几个克隆做一代测序测不出信号。我用感受态附带的质粒做了质控，可以长七八千克隆，说明感受态和电转程序都没有问题。用过NEB的Gibson连接酶，长的克隆反而更少。做了两个多月一直是这样，急求帮助啊！能帮忙找到问题的可以有额外红包奖励~~谢谢了！......提几点小的建议，供参考：1.T4DNA连接酶进行16°C过夜连接；需要做一下对照，将酶切后的载体做一个自连的反应，同样操作，看一下会不会长克隆；2.连接产物使用Glycogen进行沉淀，用无菌水重悬后再电转；这样电转的效率会高一些。3.你的回收产物浓度都太低了，尽量多做一些，让浓度高一些；

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