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载体构建/RNA干扰/过表达载体/microRNA/细胞生物学 等技术话题讨论
2021-08-14
问题描述:

首先,给大家先分享一下有关细胞的基本知识。

细胞培养过程中绝对避免如细菌,支原体,真菌的污染,这些污染将显著地影响并改变实验结果。细胞培养因组织来源的不同而异,动物细胞一般采用黏附培养或者悬浮培养。根据其增殖潜力不同而被分为三类:原代细胞细胞株,细胞系。

贴壁细胞:黏附细胞需要附着后才能生长,不断增殖的细胞在细胞培养器皿上铺成单细胞层。许多细胞在铺满细胞培养器壁后就不再增殖,有些细胞在此之后会死亡。从组织中得到的大多数细胞都是贴壁细胞。

悬浮细胞:悬浮细胞在培养基中存活和增殖,不需要黏附在细胞培养器皿上,包括造血干细胞(来源于血液,骨髓,脾脏),一些转化的细胞系以及恶性肿瘤细胞等。

原代细胞:由酶法、化学法或者机械法得到的组织碎片中的细胞迁移到细胞培养皿上形成了原代细胞,这些细胞在分散组织的过程中幸存下来,黏附或者悬浮于细胞培养液中,之后进行增殖。这些细胞不能或者仅能进行有限的细胞分裂,分裂相结束后进行衰老相,最后死亡。黏附原代培养细胞对接触抑制特别敏感,一旦铺满细胞培养皿他们就停止生长。培养原代细胞通常比培养细胞系更加困难。在实验中有时需要用到原代细胞而不是细胞系。

细胞株:从原代细胞开始的头几次传代所得到的细胞被称为细胞株。这些细胞传代几次后就衰老了,但可以导入病毒的转化因子增加细胞株的增殖代数。这些细胞的表型介于细胞株和细胞系之间,他们可以更长时间的增殖,但最终他们和细胞株一样也会衰老,停止分裂。在筛选稳定转化的细胞克隆时,使用这些细胞比原代细胞更方便。

细胞系:细胞株最终都会死亡,但他们中的某些个体发生了一些可稳定遗传的突变,这些突变使得这些细胞能够无限的增殖。这类细胞和它的后代被称为细胞系,这个过程被称为体外转化或永生化,这和体内的细胞癌变相似。无论是自发还是经过某种诱变剂的诱导,龋齿类动物的原代细胞会更容易形成细胞系。相比较而言,人的原代细胞很少会形成细胞系,但是从人癌组织中分离得到的细胞通常是永生的,可以传代成细胞系。细胞系比原代细胞和细胞株更易于使用。

下面简单先提几个问题:

问题:细胞污染问题解决(操作注意事项和污染源分析)

小编回复:

安全操作须知:操作所有可能具有感染性的材料应当遵循以下原则:操作细胞时严格按照细胞操作规程以最大可能避免操作者和细胞中可能带有的致病因子接触,操作细胞应当在合格的层流超净台中进行,注意无菌并且避免气溶胶的生成。操作完成后,所产生的废弃物应当用湿热灭菌或浸没在合适的去感染物溶液中。

无菌操作和尽量避免气溶胶产生所用的器械和溶液应该事先经过彻底灭菌,工作之前用消毒液擦拭台面,试剂瓶和手。操作过程避免形成气溶胶,吸入气溶胶是有害的。气溶胶也有可能会导致细胞之间的交叉污染。因此,应选用TD(todeliver)吸管而不是TC(tocontain)吸管,所用的吸管后端应该塞上棉花。混合溶液时避免快速的吸上吸下,吹出的液体时不要用力过猛。移液时移液管口尽量与培养瓶中液面接近。使用离心机时确保离心管盖是合上的,避免液滴残留在离心管盖附近。使用带盖的离心转头时,运行前务必盖紧。

使用层流超净台:保证层流超净台放置地方的气流不被经常搅动。避免把它安置在门口,通气口或经常有人活动的地方。超净台应放在专门的细胞培养间内。保持超净台的整洁,不把东西堆放在里面。工作之前,给工作台面和试剂瓶外表面消毒,把所有细胞操作作用到的东西都放在超净台内。有序排列器械,吸管,试剂瓶和垃圾杯,把用过的物品和干净的物品分开摆放。移动废物品时避免从干净的物品上经过。

细胞污染:细胞污染物会抑制细胞的生长,导致细胞死亡,使实验结果不一致。无论是细胞培养新手还是老手都会出现这样的问题。可以导致污染的途径举不胜举,例如不规范的操作,被污染的培养基,试剂,器械(如枪头),或是携带在操作者身上和来自其他实验室中的微生物。在动物细胞培养中,细菌,真菌,霉菌,支原体和其他种类细胞是常见的污染物。规范的操作可以帮助避免细胞被微生物和其他种类的细胞污染。为了减少偶尔细胞污染所造成的损失,我们建议冻存细胞保种,即使细胞被污染了也能够及时补充新的细胞。

微生物污染:细胞微生物污染后,有些情况下细胞培养基会变浑浊,pH值发生显著变化(通常为细菌污染)。另一些情况下,微生物污染不会使细胞培养液变浑浊,对细胞也不会产生明显的影响。例如支原体污染是一种极为常见,但极难检测到的微生物污染。

支原体污染-检测:支原体是一些体型小,生长缓慢的原核生物,它们没有细胞壁,是常见的细胞污染微生物。常用的抗生素和抗真菌药一般对支原体都没有作用。更糟糕的是,由于支原体一般不会比细胞生长更快也就不会引起细胞培养基的浑浊度和颜色变化,所以它们会长时间存在而不被发现,并会迅速传播到其他细胞中去。支原体污染会抑制细胞的代谢和生长,也会干扰细胞的核酸代谢和细胞的抗原性。急性的支原体感染会使所有的细胞状态变坏,有时候有个别细胞会形成克隆。有三种主要的检测支原体的方法:Hoeschest33258染色;支原体特异的DNA探针(FisherScientifie);基于PCR的方法(如MinervaBiolabs的VenorGeMMycoplasmaDetectionKit)。另外,ATCC和MicroBIOLOGicalAssociates都提供付费的基于PCR的支原体检测服务。

支原体污染-清除:处理支原体慢性污染的细胞最明智的方法是丢弃它,用湿热灭菌或焚烧彻底消灭污染物。处理的方法主要是用各种商业化的抗生素处理,如Mynox®MycoplasmaEliminationReagent(MinervaBiolabs),enrofloxacin(Baytril®),及tiamulin和minocycline的混合处理(BM-Cyclin)。

细胞的交叉污染:细胞被另一种快速生长的细胞污染是较为严重的问题。为避免交叉污染,需要向可以保证质量的细胞库订购细胞,在超净台中一次只处理一种细胞,给不同的细胞分别准备所需的枪头,试剂,培养基。并且定期检查细胞的形态和生长特征。


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oobio2013
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对于细胞这块,大家都不陌生,但对于做科研实验的战友们,经常会遇到诸多不太顺利的问题,又得不到很好的解决方案。请大家将日常工作中遇到的问题,都发上来,大家一起讨论,共同学习和提高。问题:细胞培养方案如何选择呢?培养的细胞如何能更稳定? 小编回复:有时候细胞传代几次后,细胞的生长速度会突然降低,而在转染过程中对细胞的毒性就会突然增加。这种不稳定可能和细胞培养条件的变化,细胞基因组的改变,还有某些细胞个体的选择性增殖有关,我们建议使用低传代系数的细胞(<50次),以规避细胞系的不稳定性,防止细胞株的衰老和转化,维持转染实验的可重复性。我们建议冻存一些细胞以备不时之需。生物危害品:人类和灵长类动物材料,手术和解剖样品必须在II级实验室中进行处理。所有的材料和器械在使用后都必须用湿热灭菌或合适的溶液浸没消毒处理。
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一切随缘1198
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请问版主,我有如下两个问题,请帮我解答一下:因为我最近在做细胞实验,但对于培养基和血清以及培养条件等,拿捏不准。不知道如何选择?请给我详细解答一下吧。还有一个问题,细胞培养方案如何选择呢?如果让培养的细胞能更稳定?非常感谢!
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oobio2013
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上面那位朋友,您好!看来您应该是刚开始从事细胞培养这部分实验吧,细胞实验其实说起来也挺容易,但想养好它,还是需要花点功夫的。下面,我就将你所提出的几点问题,帮你解答一下吧。问题:培养基和血清以及培养条件等如何选择?如果让培养的细胞能更稳定?回复:培养基的选择:常用的基础培养基包括Eagleminimalessentialmedium(MEM),DuibeccosmodifiedEaglemediun(DMEM),RPMI1640,这些培养基是氨基酸,葡萄糖,无机盐,维生素和其他营养成分的混合物。许多公司都提供不同培养基的干粉或水溶液出售。使用前通常在基础培养基中添加血清,L-谷氨酸(L-谷氨酰胺),抗生素,有时还有抗真菌药。这样的培养基被称为完全培养基。血清的成分至今尚未完全确定,但已知它含有促生长和促贴壁的因子。不同的血清在促进某种特定细胞的生长方面可能会有很大的差别。胎牛血清(FCS或称FBS)是最常用的血清,但在某些场合也可以使用更便宜一些的小牛血清(NCS)或马血清(HS)。应对不同批次的血清测试以找到培养某种细胞所需要的最佳批次的血清。L-谷氨酸是一种不稳定的氨基酸,在溶液中会慢慢变成细胞不能利用的形式,应当在使用前加入。抗生素和抗真菌药物可以作为无菌操作技术的补充以避免细胞污染。培养条件:细胞的培养条件相当重要。细胞培养箱应能够严格控制温度,CO2的浓度。大多数细胞培养在37℃,5%CO2饱和湿度的条件下。但有些细胞要求更低的温度或更低的CO2浓度。细胞培养用容器:容器的类型可以影响贴壁细胞的生长。已有商业化的无菌一次性使用的培养瓶和培养盘适合哺乳动物细胞的贴壁培养。有些原代细胞并不需要任何培养基添加剂来帮助细胞贴壁和增殖,而有的细胞却需要多种添加剂才能正常生长。常用的添加剂包括黏着分子如胶原和纤连蛋白,荷尔蒙如雌激素,和生长因子如表皮生长因子和神经生长因子。培养器皿的选择也很重要,可以选择商业化提供的一次性无菌培养器皿。问题:细胞培养方案如何选择呢?回复:有时候细胞传代几次后,细胞的生长速度会突然降低,而在转染过程中对细胞的毒性就会突然增加。这种不稳定可能和细胞培养条件的变化,细胞基因组的改变,还有某些细胞个体的选择性增殖有关,我们建议使用低传代系数的细胞(<50次),以规避细胞系的不稳定性,防止细胞株的衰老和转化,维持转染实验的可重复性。我们建议冻存一些细胞以备不时之需。生物危害品:人类和灵长类动物材料,手术和解剖样品必须在II级实验室中进行处理。所有的材料和器械在使用后都必须用湿热灭菌或合适的溶液浸没消毒处理。原始材料新鲜高质量的原始材料是原代细胞分离培养的关键。胚胎组织比成体组织更容易分散开,产生更多细胞,这些细胞增殖更快。组织的形态特征在实验前应详加观察并记录。实验方案选择用机械分离法和酶法能在更短时间得到大量的细胞,这些细胞比组织块培养法得到的细胞更能代表整个组织的情况。但也要注意尽量减少细胞暴露在蛋白酶作用下的时间,以保证细胞最大活力。细胞培养实验方案无论是培养基的准备,还是细胞的培养和传代,动物细胞的建系和维持均需要规范化的操作。应该定期检查细胞是否有污染,是否需要添加新鲜培养基或是否需要传代。以下所列的细胞培养实验方案出自这些文献:CultureofAnimalCells,AManualofBasicTechnique,CurrentProtocolsinMolecularBIOLOGy,Cells:ALabortoryManual。解答完毕,谢谢大家!本帖旨在让大家多学知识,解决日常遇到的各类问题。如有不妥之处,欢迎指正!
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oobio2013
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下面给大家普及一些关于质粒的相关知识。首先,什么是质粒呢?质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子。能稳定独立存在于染色体外,并传递到子代,现代基因工程技术中常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的,常含抗生素抗性基因,是重组DNA技术的重要工具。质粒又是如何扩增的呢?它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如果离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。获取质粒后,先在感受态细胞(DH5a等)中经转化、摇菌,再用质粒抽提试剂盒抽提。质粒是如何提取的?从细菌中分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞内,共价闭环质粒主要以超螺旋形式存在。在提取质粒的过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其他形式和构象的质粒DNA,因此在琼脂糖凝胶电泳中可能会呈现多个条带。感受态细胞是什么?受体细胞(如E.coli)经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性增强,成为能容许外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。我们常用的为DH5a、TOP10、JM109、Stbl3等菌株。这次先分享这些内容吧,欢迎大家踊跃发言,补充,同时也欢迎各位积极发言,共同提高!
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