hsa-mir-371_372_373lentivirus(1ml)
| ProductDetailsandSpecifications | ||
| ProductName | hsa-mir-371_372_373lentivirus(1ml) |  |
| ProductCatalogNumber | mir-LVc12 | |
| Price | 400.00USD | |
| ExpectedDelivery | Instock.Shipsin1-2businessdays | |
| ShippingConditions | Shippedin1mllentiviralstockondryice.Pleasenotethatadditionalshippingchargesmayapply. | |
| StorageConditions | Storeat-80degreesCelsius | |
| Protocol | Download | |
biosttia是一家总部位于圣地亚哥的公司，提供分子生物学产品和服务，支持全球的研究人员。利用我们高效的慢病毒系统，我们协助许多学术机构、生物技术和制药公司进行基因表达和抑制相关研究。Biosettia专门从事：shRNA载体系统的基因沉默慢病毒miRNA对基因的抑制作用慢病毒miRNA的功能筛选miRLocker–慢病毒miRNA抑制慢病毒的制备慢病毒基因表达诱导多能干细胞生成核酸纯化
RNA干扰（RNAi）是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA（dsRNA）使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA（miRNA）诱导特定mRNA翻译的抑制。这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。通过几种蛋白的活性（下面讨论），通过短反义核酸（siRNA和shRNA序列）锁定细胞mRNA，从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集，导致其水平的下降，最终实现抑制作用。[放大]图1. siRNA和shRNA结构。（A）siRNAs是短的RNA双链，在3‘端有两个碱基的游离。（B）shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。（C）shRNA构建用于插入表达载体。源自[1, 2]。背景调控途径的发现和组成元件早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。1993年，Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。然而，直到1998年，Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果，他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。最终确定小RNA途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA干扰途径一样。表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA（siRNA或shRNA）、Dicer酶，Argonaute蛋白家族的蛋白质（具体来说是Ago-2）、Drosha、RISC、TRBP和PACT。
表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA（siRNA或shRNA）、Dicer酶，Argonaute蛋白家族的蛋白质（具体来说是Ago-2）、Drosha、RISC、TRBP和PACT。术语描述siRNA小干扰（siRNA），有在3’端有两个碱基的游离，可激活RNA干扰，通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。shRNA短发夹RNA（shRNA），包含一个环结构，可加工成siRNA，也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解.Drosha是一种核糖核酸酶III的酶，可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA。Dicer核糖核酸酶III酶，能够将双链RNA加工成在3‘端有两个碱基游离的20-25bp的siRNA。果蝇的Dicer-2能够剪切长的双链RNA，而Dicer-1对miRNA的加工有重要作用RISC最小RNA诱导沉默复合物（RISC）包含Argonaute蛋白和相关的siRNA。也可能包含PACT、TRBP和Dicer。需要注意的是RISC的组成尚未能得到确切的描述。TRBPDicer剪切双链RNA以及随后转运给RISC的过程中需要PACT蛋白R（PKR）-激活蛋白（PACT）。Dicer和TRBP参与双链RNA剪切相关.Argonautefamilyofproteins和单链的RNA（siRNA）共同组装形成RISC。绑定21-35个核苷酸的RNA，包括miRNA和siRNA以及相关的靶mRNA，然后通过其内切核酸酶功能发挥剪切作用。剪切作用发生在反义链（引导链）RNA的第10th和第11th个核苷酸之间。表一：RNAi机制的主要组成元件。siRNA vs. shRNA作用机制两个在RNAi途径的基因沉默中具有实质利害关系的是双链小干扰RNA（siRNA）和基于载体的短发夹RNA（shRNA）。虽然siRNA和shRNA（图1）都可用于蛋白沉默，但它们的作用机制有所不同（图2）。不管是长的双链RNA还是短的约21bp碱基对的双链都能够直接被转运到组织培养的细胞中（参见转运机制获取更多细节）。虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是被转运到细胞核中的，但更普遍的看法是它们在细胞质中聚集。长的双链RNA与Dicer一起形成复合物，双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。随后这些siRNA片段与RISC结合，RISC由Argonaute-2（Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白（TRBP）组成。然后RNA的两条链分开，其中一条链从复合物上分离。5"端双链稳定性最低的那条链被选择出来，稳定的并入沉默复合物中。[放大]图2. RNAi介导的基因沉默机制。在细胞核表达后，shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中，在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在这一点上，它们与siRNA的加工方式（以短的双链形态导入细胞，然后被Dicer识别）相同。在与RISC结合并去掉其中一条RNA链后，它们识别mRNA占有互补序列，导致其降解。源自[3]。shRNA在转染/转导细胞的细胞核中的合成，形成发夹结构，茎区成对的反义和正义链与未配对的成环核苷酸连接在一起（图1b和1c）。通过与miRNA的加工相同的RNAi机制，shRNA被加工成siRNA。使用细菌或病毒载体，shRNA被导入靶细胞的细胞核内，在某些情况下，载体可以稳定地整合到基因组中。根据驱动表达的启动子的不同，shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化转录。在被Exportin-5转运到细胞质之前，这些初始的前体结构需要首先用Drosha及其双链RNA结合伴侣DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA随后被Dicer和TRBP/PACT酶切，去除发卡结构，产生在两个3‘末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后被整合到沉默复合物上去。一旦被整合到RISC后，shRNA和siRNA识别靶mRNA和降解的过程基本上是相同的。作为RISC的一部分，siRNA通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶mRNA，从而利用Ago-2的核酸酶H样活性裂解靶RNA的双链中心附近的磷酸骨架。某些生物的这个系统有一个有趣的特点，siRNA与靶mRNA的退火使siRNA作为引物，而靶mRNA作为依赖于RNA的RNA聚合酶的模板。这就合成出一个新的双链RNA，然后由Dicer酶加工，形成正反馈循环，增加了siRNA的量。应当指出的siRNA通常需要完全同源才能诱导降解。该过程图2中有阐述。人们对RISC发现靶mRNA的过程还没有很好的理解。然而，Ameres等的报告显示细胞mRNA的靶序列的亲近性影响了它的剪切。他们还指出，RISC不是作用于未折叠的RNA。他们提出了一个模型，在该模型中，RISC非特异性的方式通过随机扩散与单链RNA接触，5"末端碱基配对比3"末端更有效率。这似乎决定了RISC与靶mRNA的稳定结合。
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当然，确定miRNA与mRNA之间的互作，我们还有更直接的方法，那就是从实验上寻找物理相互作用。我们可以利用RNA诱导沉默复合物（RISC）中的Argonaut（AGO）蛋白的抗体进行免疫共沉淀（co-IP）。生物通 www.ebiotrade.com
目前更先进的方法是通过紫外线照射以交联复合物，然后开展深度测序以鉴定发现的RNA，这种方法被称为紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用这种方法来寻找miRNA的靶基因，能够明显降低miRNA结合位点的假阳性预测率，并且缩小miRNA结合位点的空间范围，可在全基因组范围内鉴定AGO蛋白与不同RNA上的结合。现在有多家公司提供CLIP-seq服务，如锐博生物。
Clontech公司（Takara旗下）也推出了一种新工具，能协助鉴定细胞中的miRNA靶点。这一工具名为MirTrap系统。它利用RISC蛋白的显性失活突变体，允许miRNA与其目标结合，但限制进一步的加工。此亚基整合到内源的Argonaute/RISC复合物中，并“锁定”miRNA-目标mRNA。显性失活亚基上的DYKDDDDK（FLAG表位）标签有助于整个Ago/RISC复合物的捕获和分离。这样就能实现miRNA及其目标的免疫沉淀，从而通过新一代测序或定量PCR来鉴定或定量。生物通
整个过程大致如下：
1. 创建miRNA模拟物。生物通 www.ebiotrade.com
2. 将这些miRNA模拟物和pMirTrap载体共转染到哺乳动物细胞，并孵育24小时。同时利用miR-132、pMirTrap载体和pMirTrap对照载体开展对照转染。
3. 利用附带的MirTrap分离试剂盒裂解转染后的细胞培养物。生物通 www.ebiotrade.com
4. 利用分离试剂盒中的磁珠对RISC复合物（其中包括靶标mRNA）进行免疫沉淀。
5. 利用附带的NucleoSpin RNA XS试剂盒分离与磁珠结合的靶标mRNA。
6. 通过qPCR或新一代测序分析分离出的RNA，鉴定出特定miRNA的靶标mRNA。
Sigma-Aldrich的MISSION Target ID cDNA文库让研究人员能够在实验室内开展全转录组范围的miRNA和ncRNA靶基因鉴定。它是个全转录组范围的cDNA文库。在文库转染和选择之后，细胞被已知miRNA转染。对于那些包含与miRNA相互作用的cDNA的细胞，它们将生存到第二轮。那些选择出的cDNA可通过测序来鉴定。这样，研究人员只需投入很少，就能实现大范围的筛选。
靶基因的验证
预测终归是预测，miRNA的靶基因还必须经过验证。这个过程与一开始寻找靶基因的过程相似，也就是抑制或过表达miRNA，然后检查mRNA或蛋白水平的反应。生物通 www.ebiotrade.com
目前最常用的方法是荧光素酶报告基因法。首先，构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3’UTR插入荧光素酶基因的3’UTR中，然后将构建好的重组载体转染到细胞中，并改变miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况，以分析3’UTR中是否含有miRNA的靶位点。
目前有多家公司提供荧光素酶报告载体或构建服务。Promega就提供pmirGLO双荧光素酶表达载体。它采用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶这两种报告基因，其中萤火虫荧光素酶（luc2）作为主要报告基因，其表达减少意味着内源性的或外源引入的miRNA 与克隆的miRNA 的靶序列发生了结合；海肾荧光素酶/新霉素基因（hRluc-neo）作为对照报告基因，既能实现归一化处理，又能筛选稳定转染的细胞系。这样就以一个载体实现了以往两个载体的功能。
就目前而言，预测和鉴定miRNA靶基因的方法虽然不少，但仍然没有一种常规方法。随着计算机算法的不断改进和生物学技术的快速发展，这种现状有望改变。让我们拭目以待吧。（生物通 余亮）
目标基因全长1800bp，通过重叠延伸的方式获得的自杀敲除组件，左右同源序列均为500bp左右，构建自杀载体（确认载体没有问题），期望进行目标基因的失活处理，但将近1个月的时间，不见任何目的克隆，故在此请各位战友指点。
采用电转的方式将自杀载体（约6700bp）导入黄色短杆菌，感受态的细胞制备采用相关文献方式，甘氨酸和吐温-30的方式进行摇菌并制备电转感受态，1800v电转（电压进行过梯度，1200、1500、1800、2200、2500。1800v效果相对较好，故选之），但电转效率仍是较低，复苏2h，浓缩涂板LBG+kan（kan浓度20ug/ml）,平板克隆很少，几次都只有20个左右的克隆。
1）克隆很少，原因可能跟菌株的电转效率有关，不知战友有没有谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌相关较好的电转经验，还请指教？
2）抗性平板克隆很少，还可能和重组效率有关，但根据pk18mobsacB质粒的特性，既然能在抗性平板生长，理论上应该是已经进行了一次重组了，但结果是不管我用pk18载体本身的Kan序列引物还是最终诱导进行PCR验证，均未证实到一次重组的发生，更不要说获得敲除失活的目的菌株了。问题是这个带有抗性的克隆到底是携带了什么使其同样具有抗性(显微检验不是杂菌）？如何有效提高或促进自杀载体在宿主内的重组效率呢？或是更有效的准确的检测验证手段？？
3）利用自杀载体的方式进行黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）的基因敲除缺失比较不易，不知有没有正在做这方面相关研究的战友，希望能够多多交流和学习。。。
不知道我的疑惑讲清楚了没有，若哪里不清楚还请指出，我再细说。。。期望xdjm们的帮助啊。。。先谢过了。。
在把目的基因两翼的序列克隆到载体上的时候，两端序列的方向是必须与染色体的方向一致吗？如果一正一反，或者是两者都反向可以敲除吗？谢谢！
1. 宿主范围广, 对人致病性低
腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。特别需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮细胞性，而人类的大多数的肿瘤就是上皮细胞来源的。另外，腺病毒的复制基因和致病基因均已相当清楚，在人群中早已流行（70-80%成人体内都有腺病毒的中和抗体存在）。人类感染野生型腺病毒后仅产生轻微的自限性症状，且病毒唑治疗有效。
2.
在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因
逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。
3.
能有效进行增殖，滴度高
腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。
4.
与人类基因同源
腺病毒载体系统一般应用人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。
5.
不整合到染色体中，无插入致突变性
逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。
6.
能在悬浮培养液中扩增
293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1～20L的生物反应器中表达重组蛋白。
7. 能同时表达多个基因
这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
正是由于具有以上一些优点，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗、和基因治疗等各个领域。
常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
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