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Biosettia/FavorPrep Plasmid DNA Extraction Midi Kit  (50)/Nucleic Acid Purification/FAPDE002-1
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Biosettia/FavorPrep Plasmid DNA Extraction Midi Kit (50)/Nucleic Acid Purification/FAPDE002-1
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Biosettia Inc.
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FAPDE002-1
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 Favorgen"s Plasmid DNA Extraction Midi Kit is designed for efficient extraction of high quality plasmid DNA from 25-100 ml of bacterial culture. This kit provides the alkaline lysis reagents and the columns packed with anion-exchanger resin. After cell lysis, plasmid DNA is bound to the resin by a gravity-flow procedure, and the contaminants are removed by wash buffer. After using this convenient kit, the purified plasmid DNA is suitable for downstream application such as transfection, in vitro transcription and translation, and all enzymatic modifications.

biosttia是一家总部位于圣地亚哥的公司,提供分子生物学产品和服务,支持全球的研究人员。利用我们高效的慢病毒系统,我们协助许多学术机构、生物技术和制药公司进行基因表达和抑制相关研究。Biosettia专门从事:shRNA载体系统的基因沉默慢病毒miRNA对基因的抑制作用慢病毒miRNA的功能筛选miRLocker–慢病毒miRNA抑制慢病毒的制备慢病毒基因表达诱导多能干细胞生成核酸纯化


RNA干扰(RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程,该过程通过双链RNA(dsRNA)使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)诱导实现靶mRNA的降解,或者通过小RNA(miRNA)诱导特定mRNA翻译的抑制。这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。通过几种蛋白的活性(下面讨论),通过短反义核酸(siRNA和shRNA序列)锁定细胞mRNA,从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集,导致其水平的下降,最终实现抑制作用。[放大]图1. siRNA和shRNA结构。(A)siRNAs是短的RNA双链,在3‘端有两个碱基的游离。(B)shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。(C)shRNA构建用于插入表达载体。源自[1, 2]。背景调控途径的发现和组成元件早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。1993年,Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。然而,直到1998年,Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果,他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。最终确定小RNA途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA干扰途径一样。表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA(siRNA或shRNA)、Dicer酶,Argonaute蛋白家族的蛋白质(具体来说是Ago-2)、Drosha、RISC、TRBP和PACT。


表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA(siRNA或shRNA)、Dicer酶,Argonaute蛋白家族的蛋白质(具体来说是Ago-2)、Drosha、RISC、TRBP和PACT。术语描述siRNA小干扰(siRNA),有在3’端有两个碱基的游离,可激活RNA干扰,通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。shRNA短发夹RNA(shRNA),包含一个环结构,可加工成siRNA,也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解.Drosha是一种核糖核酸酶III的酶,可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA。Dicer核糖核酸酶III酶,能够将双链RNA加工成在3‘端有两个碱基游离的20-25bp的siRNA。果蝇的Dicer-2能够剪切长的双链RNA,而Dicer-1对miRNA的加工有重要作用RISC最小RNA诱导沉默复合物(RISC)包含Argonaute蛋白和相关的siRNA。也可能包含PACT、TRBP和Dicer。需要注意的是RISC的组成尚未能得到确切的描述。TRBPDicer剪切双链RNA以及随后转运给RISC的过程中需要PACT蛋白R(PKR)-激活蛋白(PACT)。Dicer和TRBP参与双链RNA剪切相关.Argonautefamilyofproteins和单链的RNA(siRNA)共同组装形成RISC。绑定21-35个核苷酸的RNA,包括miRNA和siRNA以及相关的靶mRNA,然后通过其内切核酸酶功能发挥剪切作用。剪切作用发生在反义链(引导链)RNA的第10th和第11th个核苷酸之间。表一:RNAi机制的主要组成元件。siRNA vs. shRNA作用机制两个在RNAi途径的基因沉默中具有实质利害关系的是双链小干扰RNA(siRNA)和基于载体的短发夹RNA(shRNA)。虽然siRNA和shRNA(图1)都可用于蛋白沉默,但它们的作用机制有所不同(图2)。不管是长的双链RNA还是短的约21bp碱基对的双链都能够直接被转运到组织培养的细胞中(参见转运机制获取更多细节)。虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是被转运到细胞核中的,但更普遍的看法是它们在细胞质中聚集。长的双链RNA与Dicer一起形成复合物,双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。随后这些siRNA片段与RISC结合,RISC由Argonaute-2(Ago-2)、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白(TRBP)组成。然后RNA的两条链分开,其中一条链从复合物上分离。5"端双链稳定性最低的那条链被选择出来,稳定的并入沉默复合物中。[放大]图2. RNAi介导的基因沉默机制。在细胞核表达后,shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中,在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在这一点上,它们与siRNA的加工方式(以短的双链形态导入细胞,然后被Dicer识别)相同。在与RISC结合并去掉其中一条RNA链后,它们识别mRNA占有互补序列,导致其降解。源自[3]。shRNA在转染/转导细胞的细胞核中的合成,形成发夹结构,茎区成对的反义和正义链与未配对的成环核苷酸连接在一起(图1b和1c)。通过与miRNA的加工相同的RNAi机制,shRNA被加工成siRNA。使用细菌或病毒载体,shRNA被导入靶细胞的细胞核内,在某些情况下,载体可以稳定地整合到基因组中。根据驱动表达的启动子的不同,shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化转录。在被Exportin-5转运到细胞质之前,这些初始的前体结构需要首先用Drosha及其双链RNA结合伴侣DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA随后被Dicer和TRBP/PACT酶切,去除发卡结构,产生在两个3‘末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后被整合到沉默复合物上去。一旦被整合到RISC后,shRNA和siRNA识别靶mRNA和降解的过程基本上是相同的。作为RISC的一部分,siRNA通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶mRNA,从而利用Ago-2的核酸酶H样活性裂解靶RNA的双链中心附近的磷酸骨架。某些生物的这个系统有一个有趣的特点,siRNA与靶mRNA的退火使siRNA作为引物,而靶mRNA作为依赖于RNA的RNA聚合酶的模板。这就合成出一个新的双链RNA,然后由Dicer酶加工,形成正反馈循环,增加了siRNA的量。应当指出的siRNA通常需要完全同源才能诱导降解。该过程图2中有阐述。人们对RISC发现靶mRNA的过程还没有很好的理解。然而,Ameres等的报告显示细胞mRNA的靶序列的亲近性影响了它的剪切。他们还指出,RISC不是作用于未折叠的RNA。他们提出了一个模型,在该模型中,RISC非特异性的方式通过随机扩散与单链RNA接触,5"末端碱基配对比3"末端更有效率。这似乎决定了RISC与靶mRNA的稳定结合。

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2021-08-12
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2018-07-03
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2018-04-08
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稳定转染hif-1α rna干扰表达载体_有道翻译
翻译结果:
Alpha stable transfection hif - 1 RNA interference expression vector
稳定转染hif-1α rna干扰表达载体_有道翻译
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Alpha stable transfection hif - 1 RNA interference expression vector
表达载体构建正义和反义,一般用于基因功能的研究,正义为强势表达
(forced expression)或过表达(overexpression),以观察基因表型,反义则是用来抑制基因表达,以观察在目的基因的表达受到抑制的情况下表型的变化
表达载体的构建方法及步骤 123
镜音双子9536922017-10-01
有两种常用的方法。第一种是直接将PCR扩增的基因片段酶切,然后连接到酶切过的表达载体上。第二种是先把PCR产物连到过度载体上,再从过度载体抢切下目的基因,最后再连接到酶切过的表达载体上。
1、目的基因:是人们需要的特定基因,主要指编码蛋白质的结构基因,也可以是一些具有调控作用的因子.
2、基因表达载体的构建
(1)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用.(2)基因表达载体的组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因
②启动子在基因的首段,它是RNA聚合酶的结合位点,能控制着转录的开始,故②正确;
③终止子在基因的尾端,它控制着转录的结束,故③正确;
④由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分,以及目的基因导入受体细胞的方法不同,因此基因表达载体的构建是不完全相同的,
免疫沉淀
当然,确定miRNA与mRNA之间的互作,我们还有更直接的方法,那就是从实验上寻找物理相互作用。我们可以利用RNA诱导沉默复合物(RISC)中的Argonaut(AGO)蛋白的抗体进行免疫共沉淀(co-IP)。生物通 www.ebiotrade.com
目前更先进的方法是通过紫外线照射以交联复合物,然后开展深度测序以鉴定发现的RNA,这种方法被称为紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(HITS-CLIP),或CLIP-seq。利用这种方法来寻找miRNA的靶基因,能够明显降低miRNA结合位点的假阳性预测率,并且缩小miRNA结合位点的空间范围,可在全基因组范围内鉴定AGO蛋白与不同RNA上的结合。现在有多家公司提供CLIP-seq服务,如锐博生物。
Clontech公司(Takara旗下)也推出了一种新工具,能协助鉴定细胞中的miRNA靶点。这一工具名为MirTrap系统。它利用RISC蛋白的显性失活突变体,允许miRNA与其目标结合,但限制进一步的加工。此亚基整合到内源的Argonaute/RISC复合物中,并“锁定”miRNA-目标mRNA。显性失活亚基上的DYKDDDDK(FLAG表位)标签有助于整个Ago/RISC复合物的捕获和分离。这样就能实现miRNA及其目标的免疫沉淀,从而通过新一代测序或定量PCR来鉴定或定量。生物通
整个过程大致如下:
1. 创建miRNA模拟物。生物通 www.ebiotrade.com
2. 将这些miRNA模拟物和pMirTrap载体共转染到哺乳动物细胞,并孵育24小时。同时利用miR-132、pMirTrap载体和pMirTrap对照载体开展对照转染。
3. 利用附带的MirTrap分离试剂盒裂解转染后的细胞培养物。生物通 www.ebiotrade.com
4. 利用分离试剂盒中的磁珠对RISC复合物(其中包括靶标mRNA)进行免疫沉淀。
5. 利用附带的NucleoSpin RNA XS试剂盒分离与磁珠结合的靶标mRNA。
6. 通过qPCR或新一代测序分析分离出的RNA,鉴定出特定miRNA的靶标mRNA。
Sigma-Aldrich的MISSION Target ID cDNA文库让研究人员能够在实验室内开展全转录组范围的miRNA和ncRNA靶基因鉴定。它是个全转录组范围的cDNA文库。在文库转染和选择之后,细胞被已知miRNA转染。对于那些包含与miRNA相互作用的cDNA的细胞,它们将生存到第二轮。那些选择出的cDNA可通过测序来鉴定。这样,研究人员只需投入很少,就能实现大范围的筛选。
靶基因的验证
预测终归是预测,miRNA的靶基因还必须经过验证。这个过程与一开始寻找靶基因的过程相似,也就是抑制或过表达miRNA,然后检查mRNA或蛋白水平的反应。生物通 www.ebiotrade.com
目前最常用的方法是荧光素酶报告基因法。首先,构建荧光素酶表达载体,将希望鉴定的miRNA靶基因的3’UTR插入荧光素酶基因的3’UTR中,然后将构建好的重组载体转染到细胞中,并改变miRNA的表达水平,最后检测荧光素酶的表达情况,以分析3’UTR中是否含有miRNA的靶位点。
目前有多家公司提供荧光素酶报告载体或构建服务。Promega就提供pmirGLO双荧光素酶表达载体。它采用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶这两种报告基因,其中萤火虫荧光素酶(luc2)作为主要报告基因,其表达减少意味着内源性的或外源引入的miRNA 与克隆的miRNA 的靶序列发生了结合;海肾荧光素酶/新霉素基因(hRluc-neo)作为对照报告基因,既能实现归一化处理,又能筛选稳定转染的细胞系。这样就以一个载体实现了以往两个载体的功能。
就目前而言,预测和鉴定miRNA靶基因的方法虽然不少,但仍然没有一种常规方法。随着计算机算法的不断改进和生物学技术的快速发展,这种现状有望改变。让我们拭目以待吧。(生物通 余亮)

我现在手上有PMD2.G与PSPAX2两个载体,求推荐与其配套的慢病毒过表达载体,谢谢。

基因捕获载体在基因组中也有“hot”和“cold”插入位点。但是计算机模拟显示,按照单个克隆被捕获的百分比,如果以多种类型的载体进行足够多次的突变实验所获得的突变克隆就可以覆盖整个ES细胞基因组中全部基因位点 。因此,新型捕获策略和载体不断被设计应用。
早期基因捕获载体的特点是当报告基因与内源基因的读码框一致时,产生由内源蛋白的N 末端与报告基因蛋白融合的活性蛋白质 。近来对这一类载体所做的改进是在报告基因与SA 序列间插入一来源于脑、心肌炎病毒的IRES ,这样即使报告基因与捕获基因不发生融合也可产生报告基因翻译产物。尽管ES 细胞中大量基因具转录活性,为了获得全基因组突变克隆必须使用不依赖于捕获基因表达的筛选策略。因此,在第一、二代基因捕获载体中应用报告基因和含自身启动子( PGK) 的筛选标记基因neo ,抗药性的产生不需要捕获基因的表达。不同的是,第二代基因捕获载体中筛选标记基因3′末端没有polyA 加尾信号而含有一剪接供体序列 ,必须由内源基因提供polyA 加尾信号以产生稳定的筛选标记基因mRNA 而获得筛选克隆,因此与第一代载体相比,降低了基因间插入的背景。polyA 捕获载体还解决了第一代基因捕获载体突变基因信息鉴定的难题。3′- RACE 可用以鉴定polyA 捕获基因3′端编码序列或3′非翻译区(UTRs) 序列信息,对于基因鉴定比5′- UTRs 序列有用得多。用以克隆捕获特异类型蛋白编码基因的多种新型载体也已问世,如Skarnes 等利用分泌蛋白的原理及β-gal 活性在内质网被灭活的特点设计了一种载体专门用以捕获在ES 细胞中表达的编码穿膜分泌蛋白的基因 。一些研究小组还在载体中引入了重组位点,以实现由重组酶介导的捕获位点插入后修饰 。这种“敲进 ”的策略允许对捕获位点作进一步修饰,如“指派”捕获基因的启动子成分驱动敲入的转基因表达来进行“回复突变( rescue) ”或细胞标记实验;通过敲入含不同突变的捕获基因cDNA 还可产生等位基因系列;含lox 位点的载体还可实现在捕获基因组条件性取代载体产生更精细的突变,包括点突变和/ 或选择性表型标记,可以更好地控制突变的性质。向左转|向右转
生物发光,是生物素酶
世界上第一支病毒载体的基因治疗抗肿瘤药物是由哪个公司研发生产的
黄单胞菌,革兰氏阴性,进行基因敲除。
有什么样的载体可以选择?
选择的依据是什么?

敬请行家指教......
病毒量偏高了,要治疗
因为目的基因要靠运载体进入受体细胞,然后目的基因才能在受体细胞中表达。所以基因表达载体的构建是基因工程的核心