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几种海藻及海洋细菌的DNA制备方法
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所周知,海藻由于富含多糖,DNA提取是一大难题,一下是本人在试验过程中收集的海藻DNA制备方法,经试验验证可行,现在贴出来,以觞众战友。一、可大量培养的海洋细菌1、取1ml目的菌菌液至1.5ml的EP管中,5000r/m离心5分钟弃上清,菌体加入500μl水洗涤一次,5000r/m离心5分钟,弃上清,向菌体中加入200μl悬浮缓冲液。2、在200μl悬浮缓冲液中加人55℃Tirs饱和酚200μl和10%的SDS45μl混匀,在微型蜗旋混和仪上混匀,55℃温浴15分钟,并且不断振荡混匀。3、12000r/m离心5分钟,取上层水相移至新的EP管中。4、加入等量的氯仿/异戊醇抽提,12000r/m离心5分钟,转移上层水相至新管,反复抽提至界面澄清。5、取上层水相加入0.1倍的3M醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇混匀于-20℃放置2h沉淀DNA。6、12000r/m离心20分钟,沉淀DNA弃上清,用预冷的的70%的乙醇洗2次,在室温下晾干,加入40μl无菌水溶解,-20℃保存。本方法用于海洋假单孢菌、以及部分兰细菌(蓝藻)可行。二、从海水中制备细菌/浮游生物的混合DNA海洋浮游生物生物量较小,往往需要采集大量的海水样本,过滤收集特定粒径的浮游生物。这里介绍的是一种简单、快速、实用的符合环境指示基因PCR扩增需要的浮游生物模板DNA制备方法。1、取40μL水样,与等体积0.25mol/LNaOH混合,并于25℃温育过夜。2、99℃加热10min,冷却至室温,简单离心收集溶液,依次加入8μL1mol/LHCl,20μL0.5mol/LTris-HCl(pH8.0)和10μL2%(v/v,体积分数)TritonX-100,混合并离心。3、将混合溶液再次在99℃加热10min。4、制备的模板DNA溶液pH值在8到9之间,可直接用于PCR扩增反应,不需要其它纯化处理。本方法用于海洋弧菌可行。三、褐藻Approximately500mgoffreshleavesweregroundinliquidnitrogen,transferredtothelysisbuffer(1.5%CTAB,75mMTris-HCl,1.5mMEDTA,1.0MNaCl,0.5mg/mlRNaseA),andincubatedfor30minat65℃.ProteinaseK(finalconcentrationof10mg/ml)wasaddedandincubationcontinuedfor30minat37℃.Anequalvolumeofphenol:chloroform:isoamylalcohol(25:24:1)wasadded,mixedandthesamplecentrifugedat2,300gfor20min.Approximately500μlofupperaqueouslayerwastransferredtoanewtubeand50μlof10%CTAB(10%CTAB,0.7MNaCl),anequalvolumeofphenol:chloroform:isoamylalcohol(25:24:1)wasadded,mixedandthesamplecentrifugedat2,300gfor20min.Theupperaqueouslayerwastransferredtoanewtubeandanequalvolumeof1%CTAB(10%CTAB,50mMTris-HCl,10mMEDTA)wasadded,mixedandthesamplecentrifugedat1,000gfor10min.TheDNAwasprecipitated.TheDNAwaswashedwith70%ethanol.ThentheDNApelletwasair-driedandredissolvedinTE(Tris-EDTA)buffer.本方法用于鼠尾藻,可行。四、红藻1、取1g藻体,用蒸馏水洗净,加入大约2ml提取缓冲液[4%SDS,0.05MTris.HCl,pH8.0,0.1MEDTA,0.2MnaCl],在0℃冰浴中充分研磨后,加蛋白酶K(终浓度100ug/ml),在50℃水浴间断震荡3.5-4小时。2、15,000rpm离心10min,取上清液,加等体积的酚抽提,15,000rpm离心10min。3、取上清液,再以酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)及氯仿抽提,15,000rpm离心10min。4、取上清液,加入二倍体积的无水乙醇使DNA沉淀,离心,用70%的乙醇洗沉淀两次。5、干燥后,溶解在50ul无菌TE(10mMTris,0.1mMEDTA,PH8.0)中,-20℃储存备用。本方法用于紫菜孢子体、紫菜配子体、江蓠、龙须菜可行。五、甲藻1、取对数生长期的培养物,在4℃下用冷冻离心机6000rpm离心6min,收集藻细胞。2、收集的藻细胞放于液氮中冷冻半个小时后,在研钵中研磨成粉末,转移到1.5mL的灭菌离心管中,加入总体积700μL裂解缓冲液(100mMEDTA,pH8.0;10mMTris-HCl,pH8.0;1%SDS;200μg/mLProteaseK)放于55℃温浴3h,其间不时摇动。3、待溶液澄清透亮裂解完全后,用一倍体积的平衡酚抽提一次,吸取上清转移至另一灭菌管中;上清用一倍体积的平衡酚:氯仿(25:24)抽提一次,吸取上清移至另一灭菌管中;上清再用一倍体积的平衡酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提一次,吸取收集上清;收集的上清液加入十分之一体积3M醋酸纳和两倍体积冰预冷的无水乙醇,-20℃过夜放置。4、第二天12000rpm离心20min后弃去上清,DNA沉淀用70%的乙醇洗涤两次,晾干。5、最终溶解于50μLTE缓冲液(10mMTris-HClpH8.0;1mMEDTA)。本方法用于塔玛亚历山大藻、原甲藻可行。六、蓝藻(以前在reply过,现在集中到这里)solutionI:100mMNaCl,30mMTris.Cl(pH7.8),10mMEDTAsolutionII:0.1MNaCl,0.2M蔗糖,10mMEDTA裂解液:0.25mMEDTA,0.5MTris.Cl,(pH9.2),2.5%SDS,10mM?-巯基乙醇TAE:40mMTris-acetate,1mMEDTATE:20mmol/lTris.Cl(8.0),1mmol/lEDTA(8.0)1、称取1g干藻粉置于Eppendorf管中;2、加入0.5mlsolutionI,振荡1min;3、10,000rpm离心1min,弃上清;4、重新加入0.5mlsolutionI洗涤,收集沉淀;5、用0.6mlsolutionII悬浮沉淀后,加入0.2ml裂解液,剧烈振荡1min;6、55?C水浴1h;7、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提两次(10,000rpm,8min);8、用等体积的氯仿/异戊醇(10,000rpm,8min)抽提1次后收集上清;9、加入1/10体积的3MNaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇;10、室温沉淀20min,10,000rpm离心8min;11、70%乙醇洗涤沉淀除盐两次并吹干;12、50?lddH2O溶解沉淀;13、加入RNaseA去RNA,电泳检测后-20?C保存备用。本方法用于螺旋藻、节旋藻可行。

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