cDNA文库构建
| 实验方法原理 | CDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。 | ||||||||||
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| 实验材料 | mRNA 试剂、试剂盒 | DTT蒸馏水dNTPEDTASDS乙醇聚合酶琼脂糖DNA聚合酶BSAT4DNA连接酶酚氯仿异戊醇PCR纯化试剂盒 仪器、耗材 | 制冰机离心机水浴锅电泳仪离心管移液枪培养箱 实验步骤 | 一、SupersciptII—RT合成第一链 1. 在一RNase-free的0.2mlPCR管中加入xulmRNA(大约500ng)、1ulXhoIPrimer(1.4ug/ul) (5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-xulRNase-freewater （大于500ngmRNA分n管(500ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。）。 2. 混匀后，70℃反应10分钟。 3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5min。 4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂： （1）4ul5×firststrandbuffer （2）2ul0.1MDTT （3）1ul10mMdNTP(自己配制) 5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。 6. 反应完成,趁热加入1ulSupersciptII—RT，混匀。 7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。 二、cDNA第二链的合成 1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(Promega)： （1）20ul10×DNAPolymeraseIbuffer （2）6ul10mMdNTP(自己配制) （3）xulddH2O （4）1ulRNaseH(2U/ul) （5）10ulDNAPolymeraseI(10U/ul) 总体系为200ul。 2. 混匀后，16℃反应2.5小时。 3. 70℃灭活10分钟。 4. 反应完成后，得到200ulcDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上。 5. 取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kbladder，确定双链的大小范围。 注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。 三、双链cDNA末端补平 1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega)： （1）6ul10mMdNTP （2）2ulT4DNAPolymerase(8.7U/ul) （3）2ulBSA(10mg/ml) 2. 稍微离心混匀反应物，37℃反应至少30分钟，然后75℃灭活10分钟。 3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后，常温下13000g离心5分钟。 4. 离心后，吸取上清于另一1.5mleppendof管中，加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后，常温下13000g离心5分钟。 5. 吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V3MNaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀，-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA。 6. 第二日，将昨日沉淀物在4℃，13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA。 7. 离心完毕，弃上清,加入1ml70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟。 8. 离心完毕，弃上清，干燥沉淀至无乙醇气味。 注：第3，第4步可以用PCR纯化试剂盒代替。 四、PCR纯化试剂盒操作流程 1. 溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。 2. 向200ul二链补平产物中加入5倍体积的bufferPB，混匀。 3. 加入spincolumn中，13000rpm离心1min。 4. 加入0.75mlbufferPE，13000rpm离心1min。 5. 13000rpm，再离心1min。 6. 将spincolumn放入一新的离心管中，加入50ulbufferEB，静置10min。 7. 13000rpm离心2min。 8. 加入30ulbufferEB，静置10min。 9. 13000rpm离心2min。 10. 加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。 五、EcoRIadaptor加接 1. 往双链cDNA沉淀中加入9ulEcoRIadaptor(400ng/ul)，4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀。 2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂： （1）1.2ul10×LigaseBuffer （2）1ul10mMrATP （3）1ulT4DNALigase(4U/ul) 3. 混匀后，4℃连接3days或者8℃过夜连接。 六、双链cDNA末端的磷酸化及XhoI酶切 1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4DNALigase。 2. 稍微离心使反应物集中至管底，室温下放置5分钟,然后加入下列试剂： （1）1ul10×LigaseBuffer （2）1ul10mMrATP （3）6ulddH2O （4）1ulT4PNK(10U/ul) 3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟。 4. 稍微离心使反应物集中至管底。 5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂： （1）4ulXho10×Buffer （2）2ulBSA （3）5ulddH2O （4）8ulXhoI(10U/ul) 6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟。 7. 反应完成，双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。 七、胶回收cDNA 1. 配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ulEB/300ml胶。 2. 取4℃保存样品上样，40ul/孔。 3. 电泳50V，1h。 4. 紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kbcDNA片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。 5. 称取胶重，加入三倍体积bufferQXI（例如，100mg胶中加入300ulbufferQXI）。 6. 50℃水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹QIAEXII使重悬，每管中加入5ulQIAEXII。 7. 50℃水浴10min，每隔2min取出颠倒混匀数次，使QIAEXII保持悬浮。 8. 4℃，13000rpm，30s（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）。 9. 加入500ulbufferQXI，轻弹管底使QIAEXII重悬。 10. 离心并去上清（同操作8）。 11. 加入500ulbufferPE，重悬QIAEXII，离心30s，去上清。 12. 再加入500ulbufferPE，重悬QIAEXII，离心30s，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清。 13. 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ulelutionbuffer，重悬QIAEXII，静置5min，13000rpm，30s。吸上清，冰上放置。 14. 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kbladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。 15. 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。 注意事项 | 1. RNA的提取（例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定）。 2. 要构建一个高质量的cDNA文库，获得高质量的mRNA是至关重要的，所以处理mRNA样品时必须仔细小心。 3. 由于RNA酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。 4. 文库构建要选择合适的载体，常规用的是λ噬菌体，这是因为λDNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。 5. 胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。 6. 胶回收时电压要稳定。 其他 | 一、cDNA构建成功关键因素 1. 保证获得数量足够的高质量的起始RNA 构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northernblot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。 老版本CLONTECH的SMART4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。 至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。 2. 反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键 这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。 反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。 少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和PolyA结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。 3. 层析柱cDNA分级很关键 这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。 获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。 噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。 一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接，目的基因cDNA长的有10kb以上，短的只有500bp或更短。 一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接的结果，不同长度cDNA的连接效率就不一样。有的专家的经验是，根据分级结果，有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分别完成滴度检测，最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。 |
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发布于 ： 2018-07-19
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