Betagal Assay
来自 : 蚂蚁淘
Beta-galAssay
AdaptedfromCurrentProtocolsinMolecularBIOLOGy
1.Grow5mlYEPDculturestomid-logphase.2.Centrifugeandres
USPendcellsin5mlZ-buffer,thenplaceonice.3.MeasureOD600.4.Usestraight,ordilutecellmix10xor20x(40or80祃broughtto0.8mLwithZ-buffer).5.UsingPasteurpipet,add1dropof0.1%SDSand2dropsofchloroformtoeachtube.6.Vortexwellfor15sec.7.Equilibrate@30degCfor15min.8.Add160祃of4mg/mlONPG,andvortexwellfor10sec.9.Incubateat30degCandbegintiming.10.Removeafterabout15-20min(empiricallydeterminedbycolor).11.Quenchreactionbyadding400祃of1MSodiumCarbonate.12.Spindowncelldebris.13.MeasureOD420andOD550.14.CalculateUnitsusingthefollowingformula:U=1000x[(OD420)-(1.75xOD550)]/[(Time)x(Vol)xOD600]WhereVolisvolumeofcultureusedinassayinmls,andTimeisminutesat30degC.
ZBuffer:60mMNa2HPO440mMNaH2PO410mMKCl1mMMgSO450mM2-mercaptoethanolpH7.0
DONOTAUTOCLAVEONPG:4mg/mlin0.1Mpotassiumphosphatebuffer,pH7,filtersterilizedandstoredfrozen.Tomake0.1Mpotassiumphosphatebuffer,pH7,youfirstneedtomaketwosolutions:SolutionA:27.2gKH2PO4in1Lwater.SolutionB:34.8gK2HPO4in1Lwater.Mix39mlSolutionAand61mlSolutionBandthenadd100mlofwater.
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