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于Amicon Ultra超滤管的常见问题与解答
来自 : 小蚂哥

Q1 AmiconUltra超滤管的膜材质是什么?

A:Amicon Utra超滤管的膜材质为默克密理博特有的Ultracet再生纤维素膜,生产工艺严格,截留分子量明确而精准,蛋白吸附损失最小。

Q2:如果要用超滤的方法分离两种蛋白,那么这两个蛋蛋白的大小需要相差多少?

A:按照经验,建议两个蛋白的分子量要相差一个数量级(10倍)

Q3 Amicon Utra超滤管可以用于病毒浓缩么?

A:可以。对于慢病毒推荐AminconoUltra 100kDa;对于腺病毒推荐Amincon.Ultra50kDa。具体的操作步骤可以参考病毒浓缩纯化试剂盒FLVO0003和HAVO0003的产品使用说明书。另提供AAV(腺相关病毒)的制备方法供参考。

Q4 AmiconUltrari超滤管可以用酒精消毒灭菌么?

A:Amicon Utra与709%乙醇是兼容的,但是对灭菌处理的具体方法没有做相关的测试,所以无法提供更进一步的参考信息。

Q5 AmiconUltra超滤装置是否可以用于高压灭菌?

A:AmiconeUltra都是采用热封设计,不可以用高压高温灭菌。

Q6 AmiconeUltra超滤管是否不含RNA酶?

A:不保证超滤管不包含RNA酶,建议用0.1%DEPC在37度浸泡2小时,以完全灭活RNA酶;残留的DEPC可以用Milli-Q超纯水洗涤除去。

Q7:用 AmiconUltra超滤管去除去污剂是有什么需要注意的吗?

A:去污剂因其独特的性质,当浓度大于临界微团浓度度(CriticalMicelleConcentration,CMC)时,去污剂分子会聚集形成微团而改变分子构象,这有可能会影响去污剂的去除效果,具体的操作步骤请垂询默克密理博技术支持专线400-889-1988-2分机。

Q8:蛋白在浓缩时出现了沉淀,如何改进?

A:蛋白如果浓缩过快或者过度浓缩都有可能引起蛋白沉淀。建议蛋白浓缩后的最终浓度不超过20mg/ml。对于对浓缩速度敏感而容易沉淀的蛋白,建议的改进方法是

1)离心力降为推荐离心力的30%-509%

2)改选择截留分子量更大的超滤管(如原本选用10k,此时可以选择30k)

3)在浓缩过程中取出超滤管,用枪头反复吹吸几次

Q9:浓缩后发现浓缩液中没有目的蛋白,可能的原因有哪些?

A:首先,AmiconUltra超滤管的蛋白最低起始浓度为25ug/ml。请确保的样本的起始浓度大于这个浓度。其次,如果问题仍然出现,请不要丢弃样本滤过液以便用于分析可能的原因:

1)如果目的样本在滤过液中,那么请排查:

a)是否选择了合适截留分子量的超滤管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3)?

b)使用的离心力是否是在限定范围内?如果使用的是rpm,请换算成相应的g离心力,具体换算方法请垂询

c)离心机最近是否有校准过?

d)是否首次尝试这个蛋白?如果能确保用同样的超滤管对其它蛋白成功操作的话,那么有可能是这个目的蛋白的原因。有时蛋白会因其本身的一些特性性(构象差异)而影响浓缩效果,建议选用上分子量级别的超滤管(如原本选用30k,此时可以选择10k)。

2)如果目的样本也不在滤过液中,那么

a)蛋白样本起始浓度是否大于25ug/mL?

b)用来确定样本浓度的方法是什么?是否可信?

c)目的蛋白是不是沉淀了?如果是,具体解决方法请参考上面的关于蛋白沉淀问题的解释。

Q10:有时候用超滤离心管连水都离不下来来,可能是什么原因?

A:AmiconUltra超滤膜中含有微量甘油。如果出现这种情况,请先用0.1 N Na0H清洗再离心。最后用缓冲液或Milli-Q水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用,如暂时不用,请保持润湿状态,避免重新干燥。

011:说明书中推荐在室温下进行离心,考虑到蛋白的稳定性,是否可以在4℃进行离心?

A:可以,但是低温会增加蛋白样品的粘性,导致流速减慢慢,建议可将离心时间延长到原来的15倍。

Q12:如何对超滤管进行去除内毒素的处理?

A:提供的超滤管是没有经过去内毒素处理的,同时由于内毒素通常以多聚体的形式存在,大小在10-1000KD之间不等,在超滤的过程中是无法去除的。可在实验前通过先用0.5MNAOH预清洗,随后用Mili-Q水/缓冲液 buffer清洗的步骤去除大部分分内毒素。

Q13:用浓缩后的的蛋白做下游分析时发现有干扰,可能有哪些原因?

A:AmiconUltra-超滤膜含有微量甘油。如果此成分干扰分析,可用用缓冲液或MiIi-Q水预清洗。如果干扰仍然存在,用0.1NNAOH清洗,然后用缓冲液或Milli-Q水再次清洗后甩干。

Q14:怀疑浓缩过程中目的蛋白和超滤膜之间可能存在非特异性吸附,如何改善?

A:超滤管使用的是再生纤维素膜的材质,是蛋白吸附最低的超滤膜。但是对于一些疏水性蛋白或非极性蛋白,它们和膜的非特异吸附可能会増强,对于这种情况,可以尝试在实验前对超滤管进行封闭处理,也可以尝试换成AmiconUltra 0.5或2来进行实验,通过减小膜面积来降低非特异性吸附。



AmiconUltra超滤管五大设计确保最快速、最高效完成样品浓缩、脱盐、缓冲液置换!

双面垂直结构设计 
•减少浓差极化、避免堵膜,离心时间最少只需10分钟 
反转离心设计 
•最大化回收样品,避免人为误差 
死体积设计 
•避免过度离心导致样品干燥 
低吸附滤膜和聚丙烯外壳 
•减少吸附,使回收率达到90%以上 
热封膜工艺 
•杜绝黏合剂和溶出物污染

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