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- Convenient,pre-processedvectorseliminatetheneedfordigestion,gelpurification,anddephosphorylation.
- TranscriptionterminatorsflankingcloningsitestABIlizeotherwisetoxicinserts.
- Choiceofcopynumberandantibioticresistance.
- OptimizedforusewithE.cloni®10Gelectrocompetentandchemicallycompetentcells(soldseparately)
Clonequicklyandfacilitatedownstreamapplications
Lucigen’suniquecloningkitswithpre-processedvectorsandhighlycompetentcellseliminatehoursoftediouspreparationandenableefficientcloning.Ligationcanbecompletedinaslittleas30minuteswithnoclean-upneeded;onlyabriefheatdenaturationisnecessarybeforetransformation.Downstreammanipulation(e.g,mutagenesis,subsequentinsertaddition)isfacilitatedbytheminimalvectorsize(1.7-2.0kb).
StabilizedInsertsandGap-FreeCloning
Allcloningkitsincludethetranscription-andtranslation-freepSMART®vectors(Figure1),whicheliminatemanyoftheproblemsassociatedwithcloningrecalcitrantDNAinconventionalplasmidvectors.Conventionalcloningvectorscontainpromoters(e.g.,lacZpromoter)thatconstitutivelytranscribetheinsertsequence.Thistranscriptionandcoupledtranslationcandestabilizeinsertsthatcontaincodingregions,strongpromoters,shortrepeats,orincompatIBLesecondarystructures.ThecloningsiteofpSMARTvectorsdoesnotincludealaczsequence.Inaddition,strongtranscriptionterminatorsflankthecloningsitetoblockspurioustranscriptionfromthevectorandinsert-driventranscriptionintothevector.LowcopynumberversionsofpSMARTfurtherstabilizesequencesthataredifficulttomaintainintypicalvectors.
NoBackgroundProblems
ThepSMARTvectorsaresuppliedpre-digested,withblunt,dephosphorylatedends,andarequalifiedtoproduce99.5%recombinantclonesintypicalexperiments.Theultra-lowbackgroundofemptyvector(lessthan0.5%)eliminatestheneedtoscreenforrecombinants,removestheuncertaintyoffalsenegatives(lightbluepUCcolonies)andfalsepositives(whitecoloniesthatlackinserts),andenableslibraryconstructionfromnanogramamountsofDNA.
Figure1.Highcopy(HC)andlowcopy(LC)versionsofthepSMARTtranscription-freecloningvectors.
ConvenientSuccess
EfficientlyobtainyourcloneorcreateyourgenomicorCDNAlibrary—theCloneSmartCloningKitseliminatetediouspreparationofvectorsandcompetentcells,aswellastime-consumingQCtestingexperiments.Kitsincludeoptimizedreagents,ligation-readyvector(nopost-ligationcleanupsteprequired),detailedinstructions,andtrouble-shootingguidestosimplifycloningandsequencing.HighlyefficientE.cloni®10Gelectrocompetentcells(upto>4×1010cfu/µg)orchemicallycompetentcells(>1×109cfu/µg)areavailableforsaleseparately.
ORDERINFORMATION
CloneSmartBluntCloningKitscontain:VectorPremix,CloneSmartDNALigase,PositiveControlInsertDNA,SequencingPrimers,andacompleteprotocol.KitscanbeusedwithanyE.colichemicallycompetentorelectrocompetentcellsbuthavebeenoptimizedforusewithofE.cloni®ElectrocompetentCellsandChemicallyCompetentCells.蚂蚁淘电商平台
ebiomall.com
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公司简介
蚂蚁淘（www.ebiomall.cn）是中国大陆目前唯一的生物医疗科研用品B2B跨境交易平台，
该平台由多位经验丰富的生物人和IT人负责运营。蚂蚁淘B2B模式是指客户有采购意向后在蚂蚁
淘搜索全球供应信息，找到合适的产品后在蚂蚁淘下单，然后蚂蚁淘的海外买手进行跨境采购、
运输到中国口岸，最后由蚂蚁淘国内团队报关运输给客户...
蚂蚁淘承诺
正品保证： 全球直采 在线追溯
蚂蚁淘所有产品都是自运营的，我们已经跟国外多家厂方建立品牌推广合作关系, 获得对方的支持和授权； 同时客户可以通过订单详情查看到货物从厂方至客户的所有流程， 确保货物的来源； 正规报关，提供13%增值税发票。
及时交付： 限时必达 畅选无忧
蚂蚁淘的运营团队都是有着多年经验的成员，他们熟悉海外采购、仓储物流、报关等环节； 同时通过在线的流程监控，蚂蚁淘的进口速度比传统企业提高了50%以上， 部分产品甚至能做到7-10天到货，即蚂蚁淘的“时必达”服务。
轻松采购： 在线下单 简单省事
蚂蚁淘的价格是真实透明的，并且具有很大的价格优势，不需要繁杂的询价比价； 报价单与合同可以直接在线生成或打印；就像在京东购物一样， 您的鼠标点击几 次即完成在蚂蚁淘的采购，订单详情会告诉您所有进程。
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2021-08-10
毒品检测试剂盒，即为毒品快速检测试纸（试剂）盒装规格。适用范围：公安部门、禁毒机构对可疑人群的筛查； 征兵、入学体检；戒毒机构治疗监控，医疗卫生防疫部门的普查、筛查、体检等。... 查看更多
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2019-08-25
焦作路非凡生物科技有限公司在发布的通用型DNA克隆试剂盒（不包括内切酶）供应信息，浏览与通用型DNA克隆试剂盒（不包括内切酶）相关的产品或在搜索更多与通用型DNA克隆试剂盒（不包括内切酶）相关的内容。 查看更多
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2021-07-24
无缝克隆，助你成功 日期：2014年2月17日 10:24 所属类别： 促销信息 该资讯的关键词为： ... 查看更多
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2019-07-12
北京拜尔迪生物技术有限公司在发布的pUC18克隆载体供应信息，浏览与pUC18克隆载体相关的产品或在搜索更多与pUC18克隆载体相关的内容。 查看更多
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2021-08-01
FastaTM一步法克隆试剂盒; FastaTM多片段一步法克隆试剂盒如果您无法正常浏览邮件，请点击此处观看内容！若您不希望收到此类邮件，请点击退订。 FastaTM一步法克隆试剂盒 产品名称规格货号 价格（元） FastaTM One Step Cloning Kit50 rxnFOSC-50 800 非连接依赖型的快速克隆技术 • 简单、快速、高效，... 查看更多
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近岸蛋白质科技有限公司在发布的NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒试用装供应信息，浏览与NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒试用装相关的产品或在搜索更多与NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒试用装相关的内容。 查看更多
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2021-08-20
不一样的无缝克隆，仅需三步即可完成基因克隆！，Lucigen提供全新、高效快速的基因克隆方法，无需DNA纯化以及连接酶、重组酶的作用，只需三步即可完成 查看更多
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2018-12-26
1.6 TAlL-PCR 很早就有用随机引物的PCR，但由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生，所以一直未能广泛应用。近年来由IJiu等设计的TAIL-PCR(Termal Asymmetric Interlaced PCR)又叫热不对称交错PCR，则解决了这个问题，后来有研究表明，经改良过的TAIL 查看更多
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2018-12-26
2 讨论 以上介绍的几种方法基本代表了现有的启动子克隆方法，它们分别具有不同的特点和适用范围。 利用启动子探针载体筛选启动子时，不需要知道具体的基因序列，避免了引物设计，并能获得大量的启动子片段；其缺点是需要构建1个穿梭质粒，建库、转化、筛选，工作量大，费时费力，而 查看更多
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2021-08-23
实验原理重组质粒的构建T质粒载体重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。... 查看更多
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2019-05-16
服务名称：Subclon Vector Construction Services 查看更多
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2019-09-25
北京艾德莱生物科技有限公司在发布的零背景pTOPO-TA克隆试剂盒供应信息，浏览与零背景pTOPO-TA克隆试剂盒相关的产品或在搜索更多与零背景pTOPO-TA克隆试剂盒相关的内容。 查看更多
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RNA逆转录生成的是双链DNA吗?为什么?123
林羽熙Candice2017-12-02
1、先是合成与RNA互补的DNA单链，然后DNA单链在DNA聚合酶的作用下继续合成为DNA双链。2、逆转录（reverse transcription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。是RNA病毒的复制形式，需逆转录酶的催化。向左转|向右转3、过程：先是以RNA为模版，在逆转录酶的作用下合成与其碱基互补配对的DNA单链，然后再以DNA单链为模版在DNA聚合酶的作用下继续合成双链DNA。4、逆转录是RNA病毒的复制形式，需要逆转录酶的催化。5、艾滋病病毒(HIV)就是一种典型的逆转录病毒。
【求助】慢病毒pLenti7.3/V5TOPO表达系统的克隆 核酸基因技术...123
genomegao2021-08-12
大家好！请问哪位高人利用慢病毒载体做过克隆？我有一些问题请教,急需各位的帮助！我最近在做有关慢病毒表达系统的实验，购买的是Invitrogen 的TOPO克隆试剂盒，将目的基因600bp连在载体pLenti7.3/V5-TOPO载体上，转化后的第二天挑的单克隆，五个克隆中通过菌落PCR鉴定目的片段连上的只有一个克隆，提质粒后做了酶切鉴定，发现载体在LTR没有重组，但测序后发现是反向连接。两周后我重新挑克隆，菌落PCR 后发现目的片段均能扩增出来，但提质粒后酶切电泳后，发现所有我挑的十几个克隆载体的大小与原来不一样，原来是8.9Kb,现在小于4.5Kb，双酶切原来得到三条片段，现在只有一条.....难道全是重组的质粒吗？重组效率这么高吗？
请各位大侠帮忙分析一下原因！！万分感谢！！！
请各位大侠帮忙分析一下原因！！万分感谢！！！
无缝克隆后平板不长菌落 分子生物 DNA重组 论坛学术...123
小胖06142021-08-14
【共享】无需连接酶,同源重组实现无缝克隆快速克隆新方法 核酸...123
aidlab2021-08-26
您也可以自己制作无缝克隆试剂盒---SeamlessCloning（无缝克隆）简介
SeamlessCloning(无缝克隆)技术提供了一种新的、高效快速的基因克隆方法，只要插入的DNA片段末端与载体末端具有15-25个重叠碱基序列就可以在载体的任意位点完成克隆重组。
产品特点：
1.30分钟可以将一个或者多个长、短PCR扩增片段（平端、A端均可）插入载体。
2.不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。
3.无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列。
4.高效、准确，阳性率＞95%。
无缝克隆技术严格意义不是新技术，类似于乔布斯天才的集成了现成的电子元器件造出Iphone，开创了智能手机新时代一样。美国的吉布斯在2009年首次用一个新颖的思路，将3种现有的商品化的酶组合起来，达到了无缝克隆的效果，开创了无缝克隆新时代。因此，您也可以按照吉布斯的思路亲自组装无缝克隆试剂盒，领略天才的思路。当然你也可以通过购买北京艾德莱（aidlab）的无缝克隆试剂盒CV1201SeamlessAssemblyandCloningkit，体会无缝克隆的妙处。
原理说明：紫红色和绿色2个片段为需要连接的双链DNA片段，它们末端有相同的15-25个重叠序列（黑色），首先T5exonuclease核酸外切酶切去5’端的一些碱基，形成3’端突出的单链，3’端单链互补退火；然后Phusion高保真聚合酶补上两条单链之间的缺口（gaps）；最后TaqDNAligase将相邻的单链裂口（nicks）连接补齐。
以上用到的三种酶NEB公司全部有商品化销售，因此，您可以DIY自己的无缝克隆试剂盒。但是艾德莱生物也提醒您，如果您不能自己表达纯化生产这些酶降低成本，那么购买这些商品化酶DIY也会比较昂贵，不是发烧友，还是购买艾德莱生物（aidlab）帮您精心准备的CV1201SeamlessAssemblyandCloningkit。http://www.aidlab.cn/products1.asp?anclassid=91
SeamlessCloning(无缝克隆)技术提供了一种新的、高效快速的基因克隆方法，只要插入的DNA片段末端与载体末端具有15-25个重叠碱基序列就可以在载体的任意位点完成克隆重组。
产品特点：
1.30分钟可以将一个或者多个长、短PCR扩增片段（平端、A端均可）插入载体。
2.不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。
3.无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列。
4.高效、准确，阳性率＞95%。
无缝克隆技术严格意义不是新技术，类似于乔布斯天才的集成了现成的电子元器件造出Iphone，开创了智能手机新时代一样。美国的吉布斯在2009年首次用一个新颖的思路，将3种现有的商品化的酶组合起来，达到了无缝克隆的效果，开创了无缝克隆新时代。因此，您也可以按照吉布斯的思路亲自组装无缝克隆试剂盒，领略天才的思路。当然你也可以通过购买北京艾德莱（aidlab）的无缝克隆试剂盒CV1201SeamlessAssemblyandCloningkit，体会无缝克隆的妙处。
原理说明：紫红色和绿色2个片段为需要连接的双链DNA片段，它们末端有相同的15-25个重叠序列（黑色），首先T5exonuclease核酸外切酶切去5’端的一些碱基，形成3’端突出的单链，3’端单链互补退火；然后Phusion高保真聚合酶补上两条单链之间的缺口（gaps）；最后TaqDNAligase将相邻的单链裂口（nicks）连接补齐。
以上用到的三种酶NEB公司全部有商品化销售，因此，您可以DIY自己的无缝克隆试剂盒。但是艾德莱生物也提醒您，如果您不能自己表达纯化生产这些酶降低成本，那么购买这些商品化酶DIY也会比较昂贵，不是发烧友，还是购买艾德莱生物（aidlab）帮您精心准备的CV1201SeamlessAssemblyandCloningkit。http://www.aidlab.cn/products1.asp?anclassid=91
体外诊断试剂生产实施细则试题 写写帮文库123
confidebb2017-12-02
第四章厂房与设备
第十二条物制品产环境空气洁净度级别应与产品产操作相适应厂房与设施应原料、间体品造污染
第十三条产程涉及高危操作其空气净化系统等设施应符合特殊要求
第十四条物制品产操作应符合表规定相应级别洁净区内进行未列操作参照表适级别洁净区内进行：
洁净度级别
物制品产操作示例
B级背景局部A级
附录菌药品非终灭菌产品规定各工序
灌装前经除菌滤制品其配制、合并等
C级
体外免疫诊断试剂阳性血清装、抗原与抗体装
D级
原料血浆合并、组离、装前巴氏消毒
口服制剂其发酵培养密闭系统环境（暴露部需菌操作）
酶联免疫吸附试剂等体外免疫试剂配液、装、干燥、内包装
第十五条产程使用某些特定物体阶段应根据产品特性设备情况采取相应预防交叉污染措施使用专用厂房设备、阶段性产式、使用密闭系统等
第十六条灭疫苗（包括基重组疫苗）、类毒素细菌提取物等产品灭交替使用同灌装间灌装、冻干设施每装应采取充污染措施必要应进行灭菌清洗
第十七条卡介苗结核菌素产厂房必须与其制品产厂房严格产涉及物产设备应专用
第十八条致病性芽胞菌操作直至灭程完前应使用专用设施炭疽杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌破伤风梭状芽胞杆菌制品须相应专用设施内产
第十九条其种类芽孢菌产品某设施或套设施期轮换产芽胞菌制品任何间能产种产品
第二十条使用密闭系统进行物发酵同区域同产单克隆抗体重组DNA制品
第二十条菌制剂产加工区域应符合洁净度级别要求并保持相压；操作致病作用微物应专门区域内进行并保持相负压；采用菌工艺处理病原体负压区或物安全柜其周围环境应相压洁净区
第二十二条菌（毒）操作区应独立空气净化系统自病原体操作区空气循环使用；自危险度二类病原体操作区空气应通除菌滤器排放滤器性能应定期检查
第二十三条用于加工处理物体产操作区设备应便于清洁污染清洁污染效性应经验证
第二十四条用于物体培养设备应能够防止培养物受外源污染
第二十五条管道系统、阀门呼吸滤器应便于清洁灭菌宜采用线清洁、线灭菌系统密闭容器（发酵罐）阀门应能用蒸汽灭菌呼吸滤器应疏水性材质且使用效期应经验证
第二十六条应定期确认涉及菌毒种或产品直接暴露隔离、封闭系统泄漏风险
第二十七条产程病原体污染物品设备应与未使用灭菌物品设备并明显标志
第二十八条产程需要称量某些添加剂或（缓冲液）产区域存放少量物料
第二十九条洁净区内设置冷库恒温室应采取效隔离防止污染措施避免产区造污染
面GMP附录3要求关键看体外试剂哪类般没问题
1.相同房间产段产
2.同房间产且使用同空调系统
第十二条物制品产环境空气洁净度级别应与产品产操作相适应厂房与设施应原料、间体品造污染
第十三条产程涉及高危操作其空气净化系统等设施应符合特殊要求
第十四条物制品产操作应符合表规定相应级别洁净区内进行未列操作参照表适级别洁净区内进行：
洁净度级别
物制品产操作示例
B级背景局部A级
附录菌药品非终灭菌产品规定各工序
灌装前经除菌滤制品其配制、合并等
C级
体外免疫诊断试剂阳性血清装、抗原与抗体装
D级
原料血浆合并、组离、装前巴氏消毒
口服制剂其发酵培养密闭系统环境（暴露部需菌操作）
酶联免疫吸附试剂等体外免疫试剂配液、装、干燥、内包装
第十五条产程使用某些特定物体阶段应根据产品特性设备情况采取相应预防交叉污染措施使用专用厂房设备、阶段性产式、使用密闭系统等
第十六条灭疫苗（包括基重组疫苗）、类毒素细菌提取物等产品灭交替使用同灌装间灌装、冻干设施每装应采取充污染措施必要应进行灭菌清洗
第十七条卡介苗结核菌素产厂房必须与其制品产厂房严格产涉及物产设备应专用
第十八条致病性芽胞菌操作直至灭程完前应使用专用设施炭疽杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌破伤风梭状芽胞杆菌制品须相应专用设施内产
第十九条其种类芽孢菌产品某设施或套设施期轮换产芽胞菌制品任何间能产种产品
第二十条使用密闭系统进行物发酵同区域同产单克隆抗体重组DNA制品
第二十条菌制剂产加工区域应符合洁净度级别要求并保持相压；操作致病作用微物应专门区域内进行并保持相负压；采用菌工艺处理病原体负压区或物安全柜其周围环境应相压洁净区
第二十二条菌（毒）操作区应独立空气净化系统自病原体操作区空气循环使用；自危险度二类病原体操作区空气应通除菌滤器排放滤器性能应定期检查
第二十三条用于加工处理物体产操作区设备应便于清洁污染清洁污染效性应经验证
第二十四条用于物体培养设备应能够防止培养物受外源污染
第二十五条管道系统、阀门呼吸滤器应便于清洁灭菌宜采用线清洁、线灭菌系统密闭容器（发酵罐）阀门应能用蒸汽灭菌呼吸滤器应疏水性材质且使用效期应经验证
第二十六条应定期确认涉及菌毒种或产品直接暴露隔离、封闭系统泄漏风险
第二十七条产程病原体污染物品设备应与未使用灭菌物品设备并明显标志
第二十八条产程需要称量某些添加剂或（缓冲液）产区域存放少量物料
第二十九条洁净区内设置冷库恒温室应采取效隔离防止污染措施避免产区造污染
面GMP附录3要求关键看体外试剂哪类般没问题
1.相同房间产段产
2.同房间产且使用同空调系统
乙型肝炎病毒dna荧光定量结果:乘以10的8次方检 123
yiguojun1232017-12-02
结提示：病毒复制跃（属于108）体内病毒量102000000于检测限100传染性强
建议：做肝功能检查再结合肝功能情况遵医嘱进行抗病毒治疗
建议：做肝功能检查再结合肝功能情况遵医嘱进行抗病毒治疗
【求助】有人用过pcDNA3.1 TA TOPO克隆试剂盒吗? 核酸基因...123
xiaotian09032021-09-12
全长ORF克隆常见问题解答123
快乐分享2021-09-07
筛选蛋白质结晶条件的试剂盒研发进展123
抗pH汕唬2017-11-10
才能判断试剂盒筛蛋白晶体
您线粒体蛋白提取试剂盒产品特点：1.离吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜柱与柱间吸附量差异极重复性克服产试剂盒膜质量稳定弊端
2.使用优质溶胶液含传统溶胶液碘化钠高氯酸盐抑制收酶切、连接克隆等游反应
3.独特溶胶液/结合液配溶胶结合两种功能统试剂盒运用于琼脂糖DNA收、PCR产物清洁纯化、酶切产物纯化收等种情况节省需购买种试剂盒费用
4.溶胶液/结合液调制黄颜色便于观察溶胶效监测pH值变化达佳结合效提高收效率
5.改进溶胶液配,提高缓冲能力稳定性即使品变化能PH缓冲佳结合范围内
6.快速、便需要使用毒苯酚、氯仿等试剂需要乙醇沉淀.
您线粒体蛋白提取试剂盒产品特点：1.离吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜柱与柱间吸附量差异极重复性克服产试剂盒膜质量稳定弊端
2.使用优质溶胶液含传统溶胶液碘化钠高氯酸盐抑制收酶切、连接克隆等游反应
3.独特溶胶液/结合液配溶胶结合两种功能统试剂盒运用于琼脂糖DNA收、PCR产物清洁纯化、酶切产物纯化收等种情况节省需购买种试剂盒费用
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5.改进溶胶液配,提高缓冲能力稳定性即使品变化能PH缓冲佳结合范围内
6.快速、便需要使用毒苯酚、氯仿等试剂需要乙醇沉淀.
【求助】关于RNA干扰技术的问题 核酸基因技术123
whitley2021-08-09
各位大侠，俺正在准备用雪旺细胞做RNA干扰，但俺是个菜鸟，对此技术以及质粒克隆技术一窍不通，俺看了些资料，有些问题不太明白，请各位大侠不吝赐教：
1、RNA干扰基因蛋白的表达的过程是瞬间的还是一步步的，需要一段时间才能使目的基因沉默。
2、关于siRNA的合成，有好多种，但文献报道的一般是化学合成的和通过构建质粒表达载体完成的，但据俺了解，体外转录和RNA酶III酶切从时间上和价格上都比这两种方法好，为何这么多研究者青睐这两种方法呢
3、俺打算用此方法研究某个基因的功能，想先进行体外实验，然后再进行在体实验，请教各位，用哪种方法比较好？
4、如果用质粒的话，究竟用哪种质粒好呢？听说质粒比较昂贵，看到好多文献所用质粒都是惠赠的，怎么才能通过惠赠的方式获得质粒载体呢
或许俺提的这些问题过于低级，恳切希望各位高手予以解答，不才万分感激！
1、RNA干扰基因蛋白的表达的过程是瞬间的还是一步步的，需要一段时间才能使目的基因沉默。
2、关于siRNA的合成，有好多种，但文献报道的一般是化学合成的和通过构建质粒表达载体完成的，但据俺了解，体外转录和RNA酶III酶切从时间上和价格上都比这两种方法好，为何这么多研究者青睐这两种方法呢
3、俺打算用此方法研究某个基因的功能，想先进行体外实验，然后再进行在体实验，请教各位，用哪种方法比较好？
4、如果用质粒的话，究竟用哪种质粒好呢？听说质粒比较昂贵，看到好多文献所用质粒都是惠赠的，怎么才能通过惠赠的方式获得质粒载体呢
或许俺提的这些问题过于低级，恳切希望各位高手予以解答，不才万分感激！
由cDNA全长怎么得到DNA全长? 分子生物 PCR相关 论坛...123
liuhua2021-09-05
mRNA模板经反转录酶催化体外反转录cDNA步骤应该与DNA复制程类似需要原料mRNA模板四脱氧核糖核苷酸逆转录酶能量注意：获DNA片段含非编码区序列专业答).构建cDNA文库：物细胞总mRNA模板用反转录酶合互补双链cDNA接载体转入宿主建立基文库cDNA文库1、mRNA提取及其完整性确定1）总RNA提取RNA提取：APGC或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2）mRNA离高等真核物mRNA3'端均poly(A)尾总RNA通寡聚（DT）纤维柱离mRNA或利用磁珠制备纯mRNA某些情况裂解细胞用蔗糖梯度制备mRNA-核糖体复合物作提取mRNA替换途径3）mRNA纯化①按照总mRNA进行级主要用琼脂糖凝胶电泳蔗糖密度梯度离进行级；②聚核糖体免疫纯化利用抗体纯化合目肽4）mRNA完整性确定确定mRNA完整性三种：①直接检测mRNA；②测定mRNA转译能力；③检测总mRNA指导合cDNA第链能力2、cDNA合克隆1）cDNA第链合用亲层析mRNA根据mRNA3'端poly(A)尾结构原理用12~20核苷酸oligo（dT）与纯化mRNA混合oligo（dT）与poly(A)结合作反转录酶引物反转录反应产物条RNA-DNA杂交链oligo（dT）结合mRNA3'端合全cDNA需要反转录酶mRNA端移另端种全合难达尤其mRNA链建立种随机引物合cDNA随机引物种度6~10核苷酸由4种碱基随机组DNA片段与oligo（dT）仅与mRNA3'端结合同mRNA同位点结合随机引物合产物RNA-DNA杂交体cDNA克隆载体前必须种杂交体RNA转变DNA链即形双链DNA2）.双链cDNA合合cDNA第二条链两种种利用cDNA第链3'末端现发夹环特征种发夹结构反转录酶第链末端返折并且进行复制第链结合cDNA第二链提供用引物用种合双链cDNA端发夹环用单链特异S1核酸酶切S1核酸酶处理修剪cDNA顺序使cDNA丢失mRNA5'端部顺序另种用肠杆菌RNaseH进行修饰RNaseH能识别RNA-DNA杂交并其RNA切割短片段些RNA短片段仍与cDNA第链结合新合DNA所取代新合DNA存切口用DNA连接酶些切口连接起形条完整DNA链RNaseH优于S1核酸酶能获包括mRNA5'端全部或绝部更顺序cDNA3）cDNA重组载体合cDNA与载体DNA进行连接般3种：①借助于末端转移酶3'-OH端合均聚物能力双链cDNA线性化载体DNA3'-OH端别加均聚核苷酸链；②双链cDNA线性化载体DNA别用Klenow片段进行末端补平用T4DNA连接酶进行齐连接形重组体；③通粘性末端连接4）.转化重组载体DNA定条件转化入肠杆菌形携带质粒菌株同重组DNA含同cDNA基整转化含自mRNA群体各种cDNA基转化群体构该mRNA全部遗传信息cDNA基文库5）.目cDNA克隆鉴定用于cDNA文库筛选鉴定目cDNA主要3种：①核酸杂交②免疫杂交检测③cDNA同胞选择
未知基因克隆策略及进展123
liqin10132021-09-11
各位大哥大姐，大家好！
现在小弟碰见一个难题，我想克隆一个基因，但是我在NCBI一检索，发现别人只发表了这个基因的DNA全长，但是，CDNA没有发表，也没有发表文章，想请问下，在不知道CDNA的情况下，请问我应该如何做这个基因的克隆？？？（全基因组也不知道,其他生物没有这种基因）
现在小弟碰见一个难题，我想克隆一个基因，但是我在NCBI一检索，发现别人只发表了这个基因的DNA全长，但是，CDNA没有发表，也没有发表文章，想请问下，在不知道CDNA的情况下，请问我应该如何做这个基因的克隆？？？（全基因组也不知道,其他生物没有这种基因）
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