实验原理重组质粒的构建T质粒载体
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
中文名
T载体克隆
外文名
Tcarriercloning
实验原理
重组质粒的构建
酶
DNA连接酶β-半乳糖甘酶
使用技术
PCR技术
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
细菌在0°CCaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态。
LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。
一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。
而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达，从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α互补合成β—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。
清洗，5个100ml锥形瓶，1个50ml锥形瓶，6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒
准备100ml超纯水
溶液:LB300ml(液体50ml50ml，固体100ml)，0.1mol/LCaCl210ml，100mg/mlAmp1ml，
20mg/mlX-gal1ml，200mg/mlIPTG1ml。
大肠杆菌菌液1ml
感受态细胞 | 连接产物 |
4管 | 4x5=20ul做4份 |
目的基因 | T载体 | T4连接酶 | 10x冲液 |
4x4uL | 4x1uL | 4x0.5uL | 4x1uL |
灭菌：5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒，10ml超纯水，LB培养基，1.5mlEP管，大小枪头，过滤用具2副，，0.1mol/LCaCl2
20mg/mlX-galX-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺（DMF）溶解X-gal配制成的20mg/ml（取0.02gX-gal，用DMF定容为1ml）的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。（DMF二甲基甲酰胺;Dimethylformamide;N,N-Dimethylformamide;DMF;CAS：68-12-2 理化性质:无色、淡的胺味的液体。分子式C3-H7-N-O。分子量73.10。相对密度0.9445(25℃)。熔点-61℃。沸点152.8℃。）溶于DMSO，溶解度可达20mg/ml。也溶于DMF
200mg/mlIPTG在0.8ml蒸馏水中溶解0.2gIPTG后，用蒸馏水定容至1ml，用0.22μm滤器过滤除菌，贮存于-20℃。
LB培养基：
配制每升培养基,应该在950ml去离子水中加入:胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.3.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.（100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉为固体培养基）
0.1mol/LCaCl2：取0.11098g氯化钙固体定容至10ml
Amp（100mg/ml）：溶解0.1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至1ml，用0.22μm滤膜过滤除菌.
器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。
试剂
操作步骤
PCR产物与T载体直接连接：
（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16°C。
（2）取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整）
4ul目的基因
1ulT载体
0.5ulT4DNA连接酶（TAKARA,350U/ul）
1ul连接酶缓冲液10xbuffer
3.5ulddWater
总量10ul体系
（3）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C干式恒温仪（或14°C水中）中保温过夜（12-16h）。
（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化
器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml微量离心管，1.5ml微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器
试剂
E.coli菌种，LB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液，无菌ddWater，LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddwater，IPTG，X-gal。
步骤
（1）在超净工作台中，将1ml大肠杆菌菌液加入100mlLB液态培养基（不含抗菌素），37℃摇床培养过夜。
（2）取0.5ml上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2~3h，测定OD590为0.35~0.4左右（
