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启动子克隆方法研究进展(3)
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1.4 利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子

  这类方法的第一步都是酶切基因组DNA,连接载体或接头,既可以用pUCl8等质粒载体,也可以使用λDNA等噬菌体载体,只要选用的载体带有合适的酶切位点;同样根据实验需要,接头既可以是双链也可以是单链,然后根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物或接头序列进行扩增。

  1.4.1 利用载体的PCRShyamala等利用的单特异性引物PCR(SSP-PCR)对以小鼠伤寒杆菌组氨酸转运操纵子为起点进行连续步行。以M13mpl8RFDNA为载体。用PstI和AraI酶切基因组DNA,PstI和XmaI酶切载体DNA,然后连接基因组片段和载体片段,用根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物进行扩增,由于非特异片段没有单特异引物结合的位点,即使有载体连到非特异片段,也无法得到大量扩增,而使特异片段得到有效扩增。

  1.4.2 利用接头的PCR王新国等利用衔接头的方法,设计了位于单链DNA两端互补的颠倒末端重复序列,增加了反应的特异性,在胡萝卜II型转化酶基因启动子的克隆方面取得了新的进展。首先将胡萝卜基因组DNA分别用PvuI、SmaI、DraI、EcoRV酶切,并设计了1个衔接头长链序列和1个衔接头短链序列,并在衔接头短链的3"末端带有1个氨基的衔接头,能够阻止聚合酶催化的衔接头短链的延伸,同时衔接头的长链和短链之间是反向重复序列。将酶切片段与此衔接头连接,取连接产物做模板,以衔接头引物和基因特异引物做PCR,在首轮PCR中只有限定的远端基因特异引物有结合位点,当基因特异引物延伸产生的DNA链通过衔接头时,才能产生衔接头引物的结合位点,PCR才能以衔接头引物和基因特异引物进行指数扩增。而另一方面,如果非特异合成产生了DNA两端都有双链衔接头序列的PCR产物时,这种PCR产物在每次变性后,单链DNA末端的衔接头反向重复序列将形成锅柄结构,此结构比引物-模板杂交更稳定,能抑制非特异序列的指数增长。最后得到主要的PCR产物为3.4kb、1.3kb、0.6kb和0.4kb。将EcoRV-衔接头体系的PCR产物克隆、测序、同源性比较,得到1个新的胡萝卜II型转化酶基因启动子序列,它含有类似于TATAbox和CAATbox的元件,在启动子的远上游区域含多个AT富含区,该启动子的发现对于研究植物中的糖代谢具有重要的意义。接头引物的相对位置如图3所示。

  这种方法具有便于操作、实验线路简单的优点,但是特异性较差,产物需进一步杂交验证。

  1.5 YADE法

  Prashar等在扩增cDNA3"端时采用“Y”形接头,以减少接头引物的单引物扩增。

其原理是接头引物处于“Y”接头的2个分叉单链上,序列与接头一样,只有与特异引物引导合成了接头的互补序列后,接头引物才能退火参与扩增,流程如图4。

  方卫国等尝试将YADE法引入到昆虫病原真菌的分子生物学研究,并取得了成功,建立了适合于球孢白僵菌和金龟子绿僵菌YADE体系。在已克隆的类球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的基础上,利用YADE法,克隆到该基因的启动子CDEPP。

  先酶切球孢白僵菌基因组DNA,然后与“Y”形接头相连,取连接产物做模板,先以基因特异引物1做线性扩增,再以线性扩增产物为模板,以接头引物和基因特异引物2做指数扩增,只有当线性扩增时合成了含有接头引物的互补单链,接头引物才能与其发生退火,参与指数扩增,从而有效防止了接头引物的单引物扩增。最后得PCR产物,进行序列分析确定为CDEP-1的上游启动子序列。

  在应用YADE法时,内切酶的选择至关重要。好的内切酶产生适合PCR扩增的片段,太大太小都不行。为了得到合适的内切酶,需要从众多的内切酶中筛选。研究表明,不同的物种有自己合适的内切酶。YADE法延伸的起始片段可以是基因组DNA片段,也可以是cDNA片段,在延伸cDNA片段时,设计的引物需要避开内含子和外显子的边界,在内含子的位置未知的情况下,可考虑多合成1~2条特异引物,以提高扩增未知片段的机率。该方法假阳性低、效率高,理论上能扩出所有目的片段。

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