经双限制酶切割用作克隆载体的λ噬菌体DNA的制备实验
| 实验方法原理 | 置换型载体（如λ2001、λDASH、EMBL系列、Charon34、Charon35和Charon40)含有一系列的限制位点，它们在中央填充片段的两端以相反方向排列（Frischaufetal.1983）。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 噬菌体T4DNA连接酶限制性内切核酸酶λ噬菌体包装混合物 试剂、试剂盒 | ATP氯仿乙醇酚：氯仿乙酸钠焦糖凝胶上样缓冲液 仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 ATP(10mmol/L) 氯仿 乙醇 酚：氯仿（1:1，V/V) 乙酸钠（3mol/L，pH5.2) 蔗糖凝胶上样缓冲液 TE(pH7.6和pH8.0) 2.酶和缓冲液 噬菌体T4DNA连接酶 限制性内切核酸酶 3.凝胶 琼脂糖凝胶（0.7%)，用0.5XTBE，含0.5μg/ml溴化乙锭 4.核酸和寡核苷酸 λ噬菌体（置换型载体）DNA 5.专用设备 预置于68℃的水浴 6.载体和菌株 λ噬菌体包装混合物 二、方法 1.将从置换型载体中纯化的25~50μgλ噬菌体DNA与TE(pH8.0)混合至终体积为170μl。 2.加入20μl两者中任一适宜的10X限制酶缓冲液。取两份未消化的λ噬菌体DNA，每份含0.2μg，置于冰浴保存。 3.加入4倍过量（100~200单位）的两者中任一适宜限制酶，按厂家推荐的温度消化4h。 4.将反应于冰浴冷却至0℃。再取出两个0.2μg的组分，将其中之一（另一份保存至步骤10中分析）与另一份未经消化的DNA(步骤2)于68℃温育10min，以打断噬菌体DNA黏性末端。加小量（10μl)蔗糖凝胶上样缓冲液，立刻将样品加入至0.7%的琼脂糖凝胶中。 5.用酚:氯仿抽提两次和氯仿抽提一次以纯化DNA。 6.用标准的乙醇沉淀回收DNA。  7.将DNA重溶于TE(pH8.0)中，浓度为250μg/ml。加入适宜的10X限制酶缓冲液，用第二种限制酶消化，同样为4倍过量的酶反应4h。 8.用酚:氯仿抽提两次和氯仿抽提一次以纯化DNA，用标准的乙醇沉淀回收DNA。 9.将DNA重溶于TE(pH7.6)中，浓度为300~500μg/ml，取一组分（0.2μg）保存于-20℃。 10.为了检测消化过程的有效性，用只经第一种酶消化的0.2μg载体（步骤4中预留的组分）和最后制成的0.2μg载体（步骤9)进行预连接反应。从每个连接混合物中取等量（0.1μg）的DNA进行包装，对获得的噬菌体颗粒测定其滴度。 (1)用水将DNA溶液的体积调整至17μl。 (2)加入2μl10X连接缓冲液，如果必要，再加入1μl10mmol/LATP。 有些商品化连接缓冲液中含有ATP。如果用这样的缓冲液，就不再需要另加ATP。 (3)取10μl步骤(2)中制成的混合物，冰浴保存。 (4)在剩余的混合物（步骤(2))中，加入0.2~0.5weiss单位的T4DNA连接酶，16℃温育2h。 (5)用一商品化的λ噬菌体包装反应将0.1μg的连接和未连接样品以及0.1μg的未消化载体DNA进行包装。 |
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发布于 ： 2019-07-23
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