【求助】克隆基因要转到真核作表达，模板的选择问题，急急急，希望大家多多帮忙，谢谢大家
2021-08-30
问题描述：
大家好，小人是一只小小菜鸟，做实验遇到了很大的问题，希望大家伸出友爱之手，帮帮痛苦中的我
我要克隆一个基因，这个基因有3个外显子，然后和质粒相连，重组载体，转到真核细胞中做表达，我用基因组DNA做模板，请问这么做可以吗，有人做过类似的实验吗？
请大家帮帮忙，本人毕业在即，谢谢大家
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civcul
用户
在真核生物中合成的所有RNA都需要某种程度的转录后的加工过程，最简单的加工是在刚转录的RNA的特定位置进行剪接，虽然剪接后的RNA链比原来的小了，但却是具有功能的RNA。有时通过甲基化或其它的化学反应对碱基进行修饰，就象在tRNA中见到的那样，或者是象mRNA那样，转录后的RNA，在其5ˊ端加一个甲基化的“帽子”和在3ˊ端加上一个多聚腺苷酸的尾巴，构成一个功能性的mRNA。到目前为止，真核生物中的大多数RNA的加工都是通过剪接过程将原初转录物中的内含子（introns）除去。大多数真核生物中编码蛋白质的基因是由指定蛋白质氨基酸序列的外显子和散布在外显子中的非编码的内含子构成的，编码蛋白质的外显子（Exons）被插入的非编码的内含子隔开。因此在mRNA被翻译成蛋白质之前，刚转录出的RNA产物，也称之非均一RNA（heterogeneous，hnRNA）必须通过一种称之RNA剪接的机制进行加工。（下图）给出了一个hnRNA加工成mRNA的过程。与此相反，细菌基因的编码序列是连续的，并且被转录为单一的mRNA，而该mRNA不需加工就可直接作为模板翻译蛋白质。因此，你的基因必须以RNA为模板，进行RT-PCR扩增。这样可以只扩增加工好的mRNA(只含有外显子序列)。如果以DNA为模板扩增，那么会把内含子一起扩增，这样基因也不会表达。
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无双蛛蛛
用户本人感激涕零，我是寻寻觅觅啊，问了很多的人你的回答很详细而且还有图文十分感谢
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alixtardxy
用户展开引用civcul在真核生物中合成的所有RNA都需要某种程度的转录后的加工过程，........到目前为止，真核生物中的大多数RNA的加工都是通过剪接过程将原初转录物中的内含子（introns）除去.........必须通过一种称之RNA剪接的机制进行加工。（下图）给出了一个hnRNA加工成mRNA的过程。与此相反，细菌基因的编码序列是连续的，并且被转录为单一的mRNA，而该mRNA不需加工就可直接作为模板翻译蛋白质。因此，你的基因必须以RNA为模板，进行RT-PCR扩增。这样可以只扩增加工好的mRNA(只含有外显子序列)。如果以DNA为模板扩增，那么会把内含子一起扩增，这样基因也不会表达。......但是计划做的是真核表达，如果把完整的基因组序列克隆上去，转录后在真核细胞中这些加工过程还是可以完成的吧。不过我不太明白，如果仅仅是为了表达的目的，为什么要以基因组DNA为模版。
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havocking
用户alixtardxy但是计划做的是真核表达，如果把完整的基因组序列克隆上去，转录后在真核细胞中这些加工过程还是可以完成的吧。不过我不太明白，如果仅仅是为了表达的目的，为什么要以基因组DNA为模版。这个也是可行的啊？谁能给个确定的说法吗。一般构建表达载体就是连入CDS区域，难道连入完整的基因组序列进去真核细胞，最终得到的表达和连接CDS的没区别？
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寂静之声
用户civcul因此，你的基因必须以RNA为模板，进行RT-PCR扩增。这样可以只扩增加工好的mRNA(只含有外显子序列)。如果以DNA为模板扩增，那么会把内含子一起扩增，这样基因也不会表达。这个未必吧，对于真核表达，内含子的存在可以通过mRNA的剪切加工去掉。其实我觉得内含子在一定程度上可能还有利于表达，不然怎么解释下图：
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tiger22
用户寂静之声这个未必吧，对于真核表达，内含子的存在可以通过mRNA的剪切加工去掉。其实我觉得内含子在一定程度上可能还有利于表达，不然怎么解释下图：查到了这个载体的说明：theintronislocatedupstreamofCDNAinserttopreventpossIBLecrypticsplicingsitesincDNAsequence.transfectionstudiesshowedthattheintronflankingthecDNAinsertcanincreasethelvlofgeneexpression.这不是cDNA内部的intron，它可以竞争insert内部的可能存在剪切位点。疑问的是，不同种属之间，比如牛的内含子能否在老鼠细胞中顺利并正确的剪切？即使是人自身的不同组织中，转录本也可能不同。如果非要带内含子，那如何保证蛋白序列是正确的呢？
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无双蛛蛛
用户谢谢大家的关心，我正在纠结中，大家多多帮忙了
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无双蛛蛛
用户还有一个问题要向大家请教，就是用基因组DNA做模板，PCR后出来的基因主要用作什么方面？测序？序列分析？那用RNA做模板，反转录后出来的基因是用来做什么？蛋白表达？谢谢
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