基克隆需要烟草内验证功能　　基克隆利用体外重组技术,特定基其DNA顺序插入载体基克隆主要目标识别、离特异基并获基完整 全序列,确定染色体定位,阐明基化功能,明确其特定性状遗传控制关系通几十努力由于植物发育,理化,遗传等科迅速发展,使 掌握量关植物优良性状基物遗传知识,再运用先进酶物技术已经克隆与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质 及与植物发育关许基我实验室麻抗真菌蛋白基作功能克隆研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),克隆植物基探讨 其克隆,本文论述基克隆策略、及取些进展　　1　功能克隆(functional Cloning)　　功能克 隆根据性状基本化特性功能信息,鉴定已知基功能克隆(Collis,1995)其具体作:纯化相应编码蛋白构建 cDNA文库或基组文库,DNA文库基筛选根据情况主要用二种办进行,(1)纯化蛋白质进行氨基酸测序,据合寡核苷酸探针cDNA 库或基组文库筛选编码基,(2)相应编码蛋白制相应抗体探针,cDNA入载体表达库筛选相应克隆功能克隆种经典基克隆策略, 基离利用种策略　　Hain等葡萄克隆两编码白藜芦醇合二苯乙烯合酶基(Vst1Vst2),葡萄抗菌化合 物白藜芦醇存,提高灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)抗性,烟草其些植物二苯乙烯合酶,克隆该基经转基,些植物产灰质葡萄孢抗性意义(Hain 等,1985)Kondo等1989编码水稻巯基蛋白酶抑制剂基组DNA做克隆序列析(Kondo等,1989)周兆斓等构建水稻 cDNA文库,离编码水稻巯基蛋白酶抑制剂cDNA(周兆斓等,1996)植物蛋白酶抑制剂类抗虫物质,抑制摄食害虫蛋白质消 化,使害虫缺乏所需氨基酸导致非发育或死亡胡华等烟草离流行于我黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆编码该病毒外壳蛋白cDNA基(胡华等,1989)王春香等病烟草叶片离纯化马铃薯x病毒 (potato virus X, pvx),克隆完整马铃薯x病毒外壳蛋白基,并外壳蛋白基转入马铃薯,期获抗pvx病毒栽培种马铃薯(王春香等,1991)病毒外壳 蛋白(Coat protein cp)基功克隆,使转基植物产病毒外壳蛋白基介导抗性(Coat Protein Mediated Resistance CPMR)或病毒CP-RNA介导抗性Van kan 报道真菌功克隆毒基Avr9,直接利用基介导广谱高效基工程植物(Van Kan等,1991)我1995构建麻cDNA文库,制备抗体探针功离编码麻抗真菌蛋白基cDNA克隆,抗真菌基农业、医 药等面应用打基础(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997)功能克隆特点用基表达产物蛋白质克隆基、虽某性状编码基未 知其理化及代谢途径研究比较清楚,离纯化控制该性状蛋白质功能克隆关键离纯度高蛋白质要纯 蛋白质,十特异探针,策略行效采用功能克隆虽已经克隆基,由于绝数基产物目前知道所数基 难用经典克隆随着物技术发展,条新基克隆策略逐渐形,定位克隆　　2　定位克隆(Positional cloning)　　根据遗传连锁析,染色体步移基定位染色体具体位置断缩筛选区域进克隆该基,研究该基功能或抗性化机制,种策略 叫定位克隆(Monaco,1994)连锁析即通基与DNA标记间重组系数估计两者间距离,若某种性状基与DNA标记代 离,即连锁起趋势根据原理与已知某DNA标记连锁基染色体定位由于连锁析需要依赖特定基作连锁标记,即标记基 与待研基间存连锁关系,满足与待研基相连锁基实太少,所连锁析克隆数基存着定困难RFLP现使态性基标记存 于整基组内,解决连锁析难克服困难　　1980Wyman等科家首建立限制酶切片段度态性RFLP (restriction fragment length polymorphism),使任何种表型相关基定位能限制酶切片段度态性用限制性内切酶切割产DNA片段度态性呈 孟德尔式遗传,存于全基组独特态标记,RFLP使基定位变易行(Wyman等,1980)目前定位克隆般用RFLP等标记制作 遗传图谱,寻找与待测基连锁RFLP标记,获基染色体定位克隆基所RFLP发展起RAPD技术建立,待测基相 准确定位,利用已知基离与连锁未知基其基本程序构建基组文库、用已知A基探针,基组文库筛选与其同源序列 a克隆,再用a克隆探针基组文库筛选与a克隆同源序列b克隆,类推筛选未知基并离目前已番茄、烟草、麦、 水稻、豆、玉米等植物发现与抗病基紧密连锁RFLP标记并构建遗传图谱(Figdore等,1988;Heun等,1991;Smith, 1991;Diers等,1992)用种已别克隆拟南芥菜、番茄、水稻等植物关抗病基(Martin等,1993;Bent等, 1994;Mindrinos等,1994;Wenyuan等,1995) Martin等1993早用定位克隆技术克隆番茄pto基,pto基负责带毒基Avrpto细菌,丁香假单胞菌 (pseudomonas syringae pv)菌株抗性,Pto基导入病番茄转基植株增强病原菌抗性(Martin等,1993)Wenyuan等1995用技术克隆 水稻Xa21基,Xa21基真菌Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo)具抗性(Wenyuan等,1995)　　3　转座标记(transposon tagging)　　转座 基位置转移另位置DNA片段转座程原位置DNA片段(转座)并未消失,发转移转座拷贝、基发转座引起插入突 变使插入位置基失并诱导产突变型或插入位置现新编码基通转座标记基(抗药性等)检测突变基位置克隆突变基 转座标记转座作基定位标记通转座染色体插入嵌合克隆基(Fedoroff等,1984;Jones等, 1994)　　利用转座克隆植物基操作步骤主要应几面:(1) 已离转座与选择标记构建含转座质粒载体(2) 转座导入目标植物(3) 利用Southern杂交等技术检测转座否载体质粒转座目标植物基组,转座定位离目标基所缺少(4) 转座插入突变鉴定及其离(Ellis等,1992)通用于克隆植物基转座玉米Ac. Mu, SmpDs等Ac含编码转座酶基,能够自主转座,Ds含转座酶所能自主转座,Ds-Ac系统AcDs提供转座酶自主 转座用转座标记进行植物基离,首要Ac等转座转化要进行基克隆植物,目前数利用土壤农杆菌介导转化系统转座导入 目标植物(Keller等,1993;Bancroft等,1993)目前已玉米、烟草、番茄、亚麻等植物克隆抗性基(Johal Briggs,1992;Whitham等,1994;Jones等,1994;Gregory等,1995)JohalBrigge离抗灰色 蠕孢(Helminth osporium carbonum)1号种玉米HMI特异真菌抗性基该基存于玉米抗性品种,能够解蠕孢1号种产玉米具特异致病性HC毒素, 该基编码HC毒素脱毒酶使植物具抗病性(JohalBriggs,1992)转座标记原理相似T-DNA标记,两者都由于 段基插入导致染色体结构发变化产突变体,T-DNA标记产突变由于T-DNA插入导致Kenneth等利用T-DNA插入标记培育 拟南芥矮化突变体(Kenneth等,1989)　　4　工合并克隆基　　蜘蛛毒素种肽,37氨基酸,体外实 验表明能杀死种农作物害昆虫,蒋红等1995根据蜘蛛毒素氨基酸序列,采用植物偏密码、工合并克隆肽基(蒋红等, 1995)Adang 1995工合苏云金杆菌毒蛋白(Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein)基(Adang等,1995)　　5　表型克隆(phenotype cloning)　　1995JonssonWeissman提表型克隆概念(JonssonWeissman,1995),些植物目前即解基产物,没 进行基定位,已知植物表型存差异,利用表型差异或组织器官特异表达产差异克隆植物基表型克隆San等用表型差异拟南芥 克隆赤霉素合酶基(Sun等,1992)表型克隆策略试图表型与基结构或基表达特征联系起,离特定表型相关基,力求必 事先知道基化功能或图谱定位根据基表达效应直接离该基(Brown,1994)　　6　mRNA差异显示(mRNA differential display)　　1993LiangAverboukh 等科家提mRNA差异显示(mRNA DD, mRNA differential display)案(Liang等,1993)案依据高等真核物所命程病理变化,论由单基控制由基控制 ,终都通基表达质或量差异体现研究基表达差异,研究两基组差异表达基离,克隆复杂性状相关基辟重要途径该 案检测、离全任何部突变mRNA,其基本程序:(1)提取两种细胞mRNA,反转录2种cDNA(2) 定引物作随机聚合酶链反应(3) 通扩增产物电泳析,离同品间差异条带(4)差异DNA做探针(5) cDNA文库或基组文库筛选基并作功能析(Baeur等,1993)LiangPardee建立mRNA差别显示PCR (LiangPardee,1992),该同析几品间基表达,检测灵敏度高,PCR扩增,些表达量低mRNA能检测 ,应用PCR及DNA测序两种技术简单易行,目前已功用离麦热激蛋白基(Joshi等,1996)水稻蔗糖调节基(Tseng等, 1995)等　　7　减杂交(Subtractive hybridization)　　Lee等1991提减杂交技术 (Lee等,1991),植物发育程同组织或同组织同发育阶段,由于基特异性表达,其mRNA表现同,表达特异基组织 提取 mRNA,反转录cDNA,特异基表达组织提取mRNA,两者杂交,表达特异基组织特异基表达组织均表达基产物形杂交 ,特异mRNA转录cDNA仍保持单链状态,种单链cDNA离即差异表达基,Chong等用技术克隆麦春化相关基 (Chong等,1994)　　8　PCR扩增克隆　　种参考已知基序列克隆基目前已经知道植物基序 列,克隆类似基先Gene bank库找关基序列,用PCR克隆同植物基基本根据已知基序列设计并合引物,植物提取DNA进行PCR扩增, 扩增片段纯化连接合适载体,用酶切析序列析检测重组,并与已知基序列进行比较,目前已玉米、水稻、向葵、巴西豆等植物离 富含甲硫氨酸蛋白及其编码基,根据Masumura等(1989)发表10KD水稻醇溶蛋白基序列合引物,王广立等克隆水稻10KD醇溶 蛋白基(王广立等,1994)　　9　依据序列同源性克隆基　　物种、属间编码基序列同源性高于非编码区序列 基本作其种属同源基克隆前提,构建cDNA文库或基组文库,已知基序列探针筛选目克隆马德钦等根据文献报道 甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基序列作菠菜甜菜碱醛脱氢酶基克隆序列析(马德钦等,1996)　　综所述,见发现克隆基 程艰巨富收获,几十各科家基克隆激物高技术领域内走艰难曲折历程,创造发展述种种植物基 克隆,使类认识自、掌握自道路前进步前辈所创造技术疑我功克隆植物基提供快捷高效途径利用已知 序列克隆基,用同种或同属已知同源序列筛选基都比较容易,适合于克隆些研究较晚许重要农作物基获极纯蛋白质功能克隆关键,随 着蛋白质纯化技术提高,功能克隆发挥潜作用随着植物遗传图谱基定位基础研究工作提高,定位克隆发挥其巨作用